美沙拉嗪緩釋劑對2，4，6-三硝基苯磺酸誘導大鼠潰瘍性結腸炎的治療作用*

李進，鄧豫，李兆明，曹小年，李小蘭，陶德定，胡俊波，王晶

(華中科技大學同濟醫學院1.附屬同濟醫院分子醫學中心;2.免疫教研室，武漢 430030)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種非特異性炎癥性腸病。臨床表現以反復發作或持續性的腹痛、黏液膿血便、腹瀉為主，屬于慢性非特異性炎癥，其特點是病程長，反復發作，遷延不愈，難以根治［1］。免疫學發病機制和腸道菌叢紊亂，特別是細胞因子的發病機制越來越受到重視，促炎性細胞因子與抑炎性細胞因子之間的平衡失調所導致的免疫異常被視為UC的重要發病機制之一［2］。2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導的結腸炎模型，在臨床和免疫等方面與人類炎癥性腸病極為相似［3］。美沙拉嗪緩釋劑是一種緩釋劑型的5-氨基水楊酸，治療UC療效確切，可以抑制引起炎癥的前列腺素的合成和炎性遞質白三烯的形成，從而對腸黏膜的炎癥起顯著抑制作用，用于UC、潰瘍性直腸炎和克隆病(Crohn＇s disease)。筆者在本研究通過觀察美沙拉嗪緩釋劑治療UC大鼠后大鼠腸組織炎癥變化，過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性、腸組織和血清中細胞因子腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-1β 和 IL-6的蛋白水平的表達情況，為治療UC提供一些實驗參數。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康成年Wistar大鼠40只，體質量(200±20)g，購于湖北省疾病預防控制中心動物中心。TNBS購自Sigma公司，美沙拉嗪緩釋劑(商品名:艾迪沙，法國愛的發制藥集團)，5-氨基水楊酸(5-aminosalicylic acid，5-ASA)購于 Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 將40只雄性Wistar大鼠，隨機分為正常對照組、模型組、藥物治療組、陽性對照組，每組10只。除正常對照組外，其他3組造模。適當修改文獻［4-5］方法，大鼠禁食不禁水24 h后開始制備模型。用1%戊巴比妥鈉(100 mg·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠后，打開腹腔，提出結腸，在距盲腸5～6 cm的結腸處輕柔將大便擠向兩側，在擠空的2～3 cm的結腸兩端分別墊0.9%氯化鈉溶液紗布，用夾子夾住兩端，再將5%TNBS按50 mg·kg-1加入等體積50%乙醇，經1 mL注射器注入結腸內，3 min后松開夾子，將結腸放入腹腔中并關閉腹腔。造模后第1天，藥物治療組每只灌胃美沙拉嗪溶液100 mg·kg-1·d-1，模型組則灌胃等量0.9%氯化鈉溶液，正常對照組給予自由飲食，陽性對照組灌胃5-ASA 100mg·kg-1·d-1，連用7 d。每日觀察大鼠一般狀況及大便性狀，記錄體質量。

1.2.2 標本收集 藥物治療7 d后，1%戊巴比妥鈉(100 mg·kg-1)深度麻醉大鼠，將其仰臥固定于手術臺，處死大鼠，分離結腸組織，沿腸系膜縱軸剪開，冰0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，留取病變結腸組織分為3份(每份約100 mg):1份放入10%甲醛溶液送病理，進行組織學損傷觀察，另2份冷凍管液氮保存備用于MPO和逆轉錄聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測。

1.2.3 腸組織MPO活性的檢測 MPO試劑盒為南京建成公司產品，酶活力單位定義:每克組織濕片在37℃的反應體系中被過氧化氫(H2O2)分解1μmol為一個酶活力單位，以U·g-1表示。MPO單位/克組織=(測定管A值-對照管A值)/(11.3×取樣量)。腸黏膜MPO活性的測定按MPO試劑盒說明檢測。

1.2.4 腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA水平檢測 ①組織中總RNA的提取:用TRIzol試劑盒說明一步法提取。②RNA定量及電泳鑒定:取RNA樣品10μL，用紫外分光光度儀測A值。RNA純度=A260/A280。RNA濃度=A260×40，經甲醛變性凝膠電泳分析RNA提取質量。③第一鏈互補DNA(cDNA)的合成:用Fermentas逆轉錄試劑盒，合成的cDNA放入-20℃凍存。④實時定量逆轉錄PCR:采用SYBR(R)Premix Ex TaqTMRTPCR試劑盒(全式金)和MX3000P熒光定量PCR儀，按說明書操作。TNF-α、IL-1β、IL-6和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因引物由上海英俊公司合成，序列如下:IL-1β:5＇-TGTGATGTTCCCATTAGAC-3＇(forward)，5＇-AATACCACTTGTTGGCTTA-3＇(reverse)。IL-6:5＇-CCACTGCCTTCCCTACTT-3＇(forward)，5＇-TTGCCATTGCACAACTCT-3＇(reverse)。TNF-α:5＇-CCACGCTCTTCTGTCTACTG-3＇(forward)，5＇-GCTACGGGCTTGTCACTC-3＇(reverse)。GAPDH:5＇-GGCAAGTTCAACGG-CACAGTCA-3 ＇(forward)， 5＇-CTCAGCACCAGCATC-ACCCCAT -3＇(reverse)。擴增片段長度分別為122，138，117，137 bp。

1.2.5 統計學方法 實驗重復3次，取其平均值，以均數±標準差(±s)表示，采用SPSS 12.0分析實驗數據，比較各組間差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀況 造模后第1天即出現腹瀉，模型組大鼠實驗過程中一直有腹瀉，部分出現肉眼血便。藥物治療組大鼠灌胃給藥治療后腹瀉次數減少，部分有隱血陽性，一直未出現肉眼血便。正常對照組大鼠無改變。陽性對照組大鼠癥狀改善不明顯。

2.2 組織病理改變 正常對照組大鼠直結腸組織見腺體排列整齊，隱窩正常，杯狀細胞無減少，未見黏膜糜爛、出血，模型組鏡下可見腺管排列紊亂，或者消失黏膜及黏膜下層血管高度擴張充血，大量炎細胞浸潤，浸潤黏膜下或固有層，部分浸潤全層，以中性粒細胞、淋巴細胞為主。藥物治療組鏡下黏膜及黏膜淺層僅有少量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，組織損傷較輕，炎癥程度較模型組明顯減輕。陽性對照組可見黏膜消失或部分消失，腺體排列紊亂，炎性細胞浸潤，但較模型組有所減輕。見圖1。

2.3 腸黏膜MPO活性檢測 模型組MPO的活性為(1.82±0.34)，藥物治療組為(0.63±0.11)，陽性對照組為(1.48±0.26)，正常對照組為(0.12±0.025)，藥物治療組較模型組和陽性對照組表達量明顯減少，差異均有統計學意義(均P＜0.05)，陽性對照組較模型組表達量有所減少，差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.4 結腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA表達水平檢測 結果見圖2。藥物治療組與模型組或陽性對照組比較，差異均有統計學意義(均P＜0.05)。陽性對照組較模型組表達量有所減少，差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

目前認為細胞因子的失衡是UC產生腸道非特異性炎性反應的關鍵環節［6-8］。與UC關系密切的促炎細胞因子主要有 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 等，抑炎細胞因子主要有IL-4、IL-10等，它們可同時或相繼、直接或間接作用靶細胞，形成細胞因子的網絡，在UC的組織破壞及炎性反應中起著重要作用［9］。

圖1 4組大鼠腸黏膜病理圖片(HE，×100)A.正常對照組;B.模型組;C.藥物治療組;D.陽性對照組Fig．1 The pathological images of intestinalmucosa of rats in four groups(HE，×100)A.the normal control group;B.themodel control group;C.the drug treatment group;D.the positive control group

圖2 4 組 TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA 相對表達量A.正常對照組;B.模型組;C.藥物治療組;D.陽性對照組;與模型組或陽性對照組比較，*1 P＜0.05Fig．2 Them RMA relative expression of TNF-α，IL-1β and IL-6 in four groups A.the normal control group;B.themodel control group;C.the drug treatmentgroup;D.the positive controlgroup;Compared with the

IL-1β曾被稱作淋巴細胞激活因子，主要由單核巨噬細胞產生。EVENIKOA等［10］發現UC患者IL-1β model control group and the positive control group，*1P ＜0.05主要是局部發揮作用，在UC有隱窩炎癥時，腸液中IL-1β含量明顯增加，與抗原協同作用，使CD+4T細胞活化，IL-2R表達，促進B細胞生長和活化，促進單核巨噬細胞等抗原遞呈細胞的抗原的表達，吸引中性粒細胞聚集，引起炎癥遞質釋放。丁偉群等［11］研究發現IL-1β在受累黏膜顯著的升高，未受累黏膜IL-1β也明顯高于正常組，說明IL-1B確實參與UC發生和發展過程。本研究發現，IL-1βmRNA在模型組相對于GAPDH的表達量達到59.4%，較其他促炎因子明顯增高。說明IL-1β可能在UC發病的初始階段和進展階段均起著非常重要的作用。本實驗采用的造模方法在傳統的造模方法上進行了適當修改，其優點是誘導的UC病變部位固定，大小、炎癥程度穩定，并且大鼠的死亡率降低，便于在實驗過程中進行觀察和比較干預效果及減少個體差異性。美沙拉嗪是一種控釋劑型的5-氨基水楊酸，治療UC療效確切，其在胃和小腸內不被吸收、分解，到達結腸后才緩慢釋放5-ASA，作用于結腸炎癥黏膜。本研究證實大鼠應用美沙拉嗪治療后，顯著改善UC的癥狀，MPO的活性明顯低于模型組和陽性對照組，表明美沙拉嗪具有減輕腸黏膜水腫，對抗炎性細胞浸潤，發揮抗炎作用。同時與模型組和陽性對照組相比明顯抑制了促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 基因的轉錄活性，降低了 TNF-α、IL-1β、IL-6細胞因子的表達，從而減輕了炎癥反應，而陽性對照組治療效果不明顯，與其在上消化道被吸收，到達病變部位的量少有關，同時證實美沙拉嗪通過在結腸內緩慢釋放5-ASA，作用于病變部位的黏膜，抑制炎性水腫、炎性細胞的浸潤，及促炎因子的表達從而發揮了治療潰瘍性結腸炎的目的。為其臨床應用價值提供了一定的理論依據。

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