銀耳多糖的抗腫瘤作用及其機制*

韓英，徐文清，楊福軍，沈秀，洪閣，黃潔，周則衛

(中國醫學科學院放射醫學研究所，天津市分子核醫學重點實驗室，天津 300192)

銀耳(Tremella fuciformis Berk)又稱白木耳，為常用保健品，其主要化學成分為銀耳多糖［1-2］。大量實驗研究表明，銀耳多糖具有抗輻射［3］、抗氧化［4］、增強免疫力［5］、升高白細胞、降血糖以及抗腫瘤等作用［6］。研究表明，藥物抗腫瘤作用的機制與增強免疫和誘導凋亡等有關［7］。為了進一步開發銀耳多糖的藥用價值，研究其抗腫瘤作用的機制，筆者從銀耳孢子發醇粉中提取、分離得到了一種均一體銀耳孢子多糖，觀察其對小鼠H22肝癌的抑制作用，用基因芯片技術初步探討銀耳多糖抑制肝癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 銀耳多糖(相對分子質量為68 000，中國醫學科學院放射醫學研究所藥物室從銀耳孢子發酵粉中提取、分離得到的均一體多糖)，香菇多糖(福州梅峰制藥廠，批號:041201)，氟尿嘧啶(南通海爾斯藥業有限公司，批號:20040301)，順鉑(云南生物谷燈盞花藥業有限公司，批號:20040701)，H22肝癌細胞株(天津市醫藥科學研究所)。昆明種小鼠，體質量18～22 g，雌雄兼用，軍事醫學科學院動物室，許可證號:SCXK-(軍)2002-001。芯片類型:BiostarM-40s，上海聯合基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 荷H22肝癌小鼠模型的建立 100只實驗小鼠，每只左腋窩皮下接種瘤細胞懸液0.2 mL，活細胞數為1×106。

1.2.2 分組與給藥 接種后隨機分為藥物組和對照組，藥物組分高、中、低3個劑量組，于接種后第2天分別腹腔注射銀耳多糖12，6和1 mg·kg-1，間隔2 d給藥1次，共給藥3次，陽性藥(順鉑、香菇多糖)采用相同給藥方式，對照組只給予0.9%氯化鈉溶液。為了比較給藥方式對腫瘤的抑制作用，設銀耳多糖連續給藥組(給藥10次)。基因芯片實驗用腫瘤組織，每組選取6 mg·kg-1作為樣本。

1.2.3 療效評價 停藥24 h處死小鼠，稱定體質量，解剖，剝離瘤塊，稱瘤質量。腫瘤抑制率=(對照組平均瘤質量-給藥組平均瘤質量)/對照組平均瘤重×100%。基因芯片實驗用腫瘤組織放置在液氮罐中保存。

1.2.4 總RNA的提取及純化 取凍存的實驗組(15只)和對照組(15只)腫瘤組織，按組別用組織勻漿機分別混勻，用UNIzol試劑抽提腫瘤組織的總RNA，紫外分析及電泳檢測。用OligotexmRNA Midi試劑盒純化mRNA。

1.2.5 探針標記 逆轉錄標記cDNA探針并純化。用Cy5-dUTP和Cy3-dUTP標記實驗組和對照組腫瘤組織的mRNA，經乙醇沉淀后溶解在雜交液中。

1.2.6 芯片雜交與熒光掃描 將基因芯片和雜交探針置于95℃水浴中變性2 min;將探針置于芯片上，用蓋玻片覆蓋，置于雜交艙中，用Parafilm密封，放入42℃雜交箱內雜交過夜(16～18 h)。然后去除蓋玻片，洗滌、晾干。用Scan Array 4000掃描儀掃描芯片，Gene Pix Pro 3.0圖像處理軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號的強度和比值，基因差異表達標準:Cy5和Cy3的比值＜0.5為表達下調，0.5～2.0表示差異無統計學意義，＞2.0表達上調。

1.2.7 統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件進行，多組間比較用One-Way ANOVA檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 銀耳多糖抑制小鼠H22肝癌實驗 順鉑對小鼠H22肝癌具有明顯的抑制作用。香菇多糖和銀耳多糖對H22肝癌均具有一定的抑制作用，與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。但順鉑影響小鼠的生長，使其體質量減輕。相反，香菇多糖和銀耳多糖可促進小鼠體質量增加，與對照組比較，體質量增加明顯。見表1。銀耳多糖對荷H22肝癌小鼠肝、脾、胸腺指數的影響見表2。結果表明，順鉑可明顯傷及小鼠的肝、脾、胸腺等器官，使其萎縮。相反，香菇多糖和銀耳多糖可促使小鼠肝、脾、胸腺等器官有一定程度的增長。因為脾、胸腺為免疫器官，因此可見，香菇多糖和銀耳多糖可促進小鼠免疫功能的增強。

2.2 總RNA電泳分析 抽提出的樣品和對照的總RNA通過電泳，進行純度分析。結果如圖1。結果表明，RNA樣本的A260/A280的比值為1.9～2.0，總RNA電泳圖譜有清晰的28S，18S條帶證明抽提得到高純化的總RNA，可以用于基因芯片研究。

2.3 芯片檢測結果 本實驗結果經Scan Array 4000掃描儀掃描，用BiostarM-40s圖像處理軟件:Gene Pix Pro 3.0處理掃描結果，用Cy5/Cy3信號比值判定結果。結果見圖2。圖中，X軸、Y軸分別以Cy3和Cy5熒光強度值(前景值-背景值)和熒度值為坐標，每一個數據點代表芯片上一個基因點的雜交信號;數據點若為紅色，則代表Y值與X值的比值在0.5～2.0，基本屬非差異表達;數據點若為黃色，則代表Y值與X值的比值＜0.5或＞2.0，該點很可能屬于表達差異。分析結果表明，共有324數據點為黃色，表明有324個基因有表達差異。其中表達上調基因185個，表達下調基因139個。因為差異表達基因數量太多，不再具體列出基因編號和強度比值。

3 討論

在抑制H22肝癌實驗中，連續給藥組抑制腫瘤效果不如間隔給藥組，原因可能是銀耳多糖作為免疫調節劑發揮抗腫瘤作用，連續給藥會造成免疫麻痹，從而使抑瘤效果降低。

表1 7組小鼠H22肝癌抑制實驗結果Tab．1 The inhibition effect of H22 hepatoma ofm ice in seven groups ±s

表1 7組小鼠H22肝癌抑制實驗結果Tab．1 The inhibition effect of H22 hepatoma ofm ice in seven groups ±s

與對照組比較，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05Compared with control group，*1 P ＜0.01，*2 P ＜0.05

組別 劑量/(mg·kg-1)小鼠/只給藥次數/次體質量增長 瘤質量g抑瘤率/%銀耳多糖低劑量組 1 10 3 6.82±2.33*1 1.66±1.09*1 59.0中劑量組 6 10 3 7.20±1.52*1 1.12±0.76*1 72.3高劑量組 12 10 3 6.27±1.93*2 1.77±1.04*1 56.3連續給藥組 12 10 10 5.51±3.04 2.18±1.41*1 46.2香菇多糖組 1 10 3 7.93±2.55*1 1.50±1.17*1 63.0順鉑組 5.3 10 3 -4.49±1.75*1 0.93±0.15*1 90.4對照組 … 10 … 3.20±3.18 4.05±1.27…

表2 7組荷瘤小鼠肝、脾、胸腺指數比較Tab．2 The comparisons of liver，spleen and thymus index of tunor-bearingm ice in seven groups mg·g-1，±s

表2 7組荷瘤小鼠肝、脾、胸腺指數比較Tab．2 The comparisons of liver，spleen and thymus index of tunor-bearingm ice in seven groups mg·g-1，±s

與對照組比較，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01Compared with control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg-1)小鼠/只給藥次數/次肝指數 脾指數 胸腺指數銀耳多糖低劑量組 1 10 3 25.2±4.0 15.74±3.62 4.08±0.99*1中劑量組 6 10 3 24.3±4.7 14.89±3.41 4.55±0.97高劑量組 12 10 3 22.5±3.4 16.06±4.08 4.84±1.11*1連續給藥組 12 10 10 23.3±2.6 17.31±2.88 4.44±1.48香菇多糖組 1 10 3 24.7±2.8 16.32±3.17 3.04±0.58順鉑組 5.3 10 3 9.8±1.9*2 3.36±1.34*2 1.65±0.54*2對照組 … 10 …22.7±6.3 13.44±4.60 3.61±0.91

不同組織樣本(對照組/實驗組)雜交信號強度散點圖，只是一個示意圖，表明在基因芯片上表達差異基因與非差異表達基因的數量，具體基因的變化在圖1中表現不出來。通過追蹤文獻以及與功能基因芯片信息的比對分析，可以將這些表達差異基因分為以下幾個方面。①信號轉導基因，如:鈣信號分子基因，信號轉導蛋白基因，JAK-STAT通路基因，應激/熱休克通路基因等。②干細胞和分化細胞的分子標志基因，如:GOLLI-MBP/HMBPR， LC1/MAP5， Tubb3， Actc1，GREMLIN2/PRDC。③細胞因子、轉錄因子基因，如:DISM2/PPP1C，GABPA。④細胞基質和細胞粘連相關基因，如:COL3A-1/MMS10-W，DC/DSPG2。⑤轉運和泵基因，如:SUR2/SUR2A，ANT2，ATP5B。⑥乳腺癌直接相關基因，如:RAC2，24P3/NGAL。⑦p53上游信號/p53調節劑基因，p53信號通路基因，如:CSNK1A，BETA/REV-ERB。⑧DNA損傷檢測/p53和ATM通路基因，如:TI-225，ABL/C-ABL。⑨抗原遞呈基因，如:CD1A/CD1D。⑩化療應答相關基因，如:9630030H21。○11 G1 期基因，如:Rbl2，CRK3。

在用基因表達芯片研究銀耳多糖抑制腫瘤作用的機制中，發現324個表達差異基因，在這些表達差異的上調/下調基因中，許多是與銀耳多糖增強免疫和抗腫瘤作用相一致的。如抗原呈遞基因(如CD1A/CD1D)表達上調，可以增強免疫系統對腫瘤的殺傷作用。化療應答相關基因(如9630030H21)表達上調，可以增強腫瘤組織對化療藥物的敏感性，提高化療藥物對腫瘤殺傷作用。DNA損傷檢測/p53和ATM通路基因(如TI-225、ABL/C-ABL)和G1期基因(如Rbl2、CRK3)均表達上調，具有異曲同工的作用。p53蛋白在細胞生長調節中具有重要作用，特別是在G1期調控點中的調節作用，它能抑制細胞生長，使被抑制細胞停留在G1期。研究表明，p53阻抑細胞于G1期，可能與影響相關的基因轉錄和DNA修復事件有關［8］。當細胞內存在DNA損傷時，有兩個檢查點控制細胞周期進程。其中，G1/S期及S期的檢查點阻止損傷了的DNA進入S期進行復制，這樣就避免新合成的DNA將損傷固定下來，防止損傷的DNA進行復制。終止DNA復制，細胞被停滯在G1期，這樣就能夠有足夠的時間使損傷的DNA得以完成修復，從而避免錯誤信息的轉錄，控制基因突變過程，保證遺傳性能的穩定性。如果DNA損傷不能得到有效修復，則p53也可誘導編程性細胞死亡［9］。

銀耳多糖體內抑制腫瘤作用也是其進入體液后，作用于體內一系列的調控系統，調節相關基因的表達，發揮其腫瘤抑制效應的結果。表達譜基因芯片是用于基因組功能研究的一種應用型芯片，在功能基因組學研究中發揮廣泛的作用［10］。本研究采用基因芯片分析手段，具有高通量和快速等優點。篩選得到了大量與腫瘤發生、發展和理化治療相關的差異表達基因。通過對這些差異基因的進一步研究，有希望找到銀耳多糖治療腫瘤的新的藥物作用靶點，同時，還可以發現銀耳多糖其他作用靶點，拓展其臨床應用范圍，以期發揮更大的經濟和社會效益。

［1］ 徐文清，高文遠，王雪姣，等.銀耳孢子多糖TFA結構的研究［J］.中草藥，2008，39(8):1140-1142.

［2］ 徐文清，王雪姣，黃潔，等.銀耳堿提孢子多糖A-BTF的分離及結構分析［J］.天然產物研究與開發，2007，19(6):1055-1058.

［3］ 徐文清，沈秀，周則衛，等.銀耳多糖對放射和化學損傷小鼠造血功能的保護作用［J］.中草藥，2006，37(7):1057-1058.

［4］ 沈衛，曲丹，蔡東聯，等.銀耳多糖對半乳糖所致衰老小鼠抗氧化能力的影響［J］.中華臨床營養雜志，2009，17(3):158-160.

［5］ 侯建明，王愛東，雷清新，等.銀耳多糖對免疫功能影響的實驗報告［J］.中國療養醫學，2007，16(11):641-643.

［6］ 陳飛飛，蔡東聯.銀耳多糖的主要生物學效用研究進展［J］.中西醫結合學報，2008，6(8):862-866.

［7］ 李璐，畢富勇，呂俊.銀耳多糖誘導肝癌HepG-2細胞凋亡的研究［J］.實用醫學雜志，2009，25(7):1033-1035.

［8］ 汪堃仁，薛紹白，柳惠圖.細胞生物學［M］.北京:北京師范大學出版社，2000:501-508.

［9］ 夏壽萱.放射生物學［M］.北京:軍事醫學科學出版社，1998:245-248.

［10］ 徐偉文，李文全，毛裕民.表達譜基因芯片［J］.生物化學與生物物理進展，2001，28(6):822-826.