驅白巴布期膠囊治療豚鼠實驗性白癜風作用研究*

彭英，霍仕霞，康雨彤，閆明

(1.石河子大學藥學院，832000;2.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，烏魯木齊 830049)

白癜風是一種常見的皮膚疾病，其發病機制尚不清楚，存在自身免疫學說、黑素細胞自毀學說等假說。其中黑素細胞學說中的黑素減少是本病的表觀顯示指標，可能與本病的發生有直接聯系，黑素細胞的生成過程又與酪氨酸酶直接相關。筆者在本實驗以維吾爾醫治療白癜風的傳統復方驅白巴布期膠囊為研究對象，通過動物實驗考察其對實驗性白癜風的作用，對其療效做初步判斷，為進一步進行驅白巴布期膠囊的作用機制探討做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試藥物 驅白巴布期膠囊由補骨脂、驅蟲斑鳩菊、高良姜、白花丹、盒果藤等5味藥材制成，由新疆華康藥業提供，批號:100140。常溫下保存，配制方法:溶解在5%羧甲基纖維素鈉水溶液中(劑量依據:人臨床劑量換算成豚鼠劑量，單位:mg·kg-1·d-1)。

1.1.2 儀器 生物組織攤烤片機(KZPG-1A)，生物組織包埋機(BMG-1)，切片機(RM2235)，光學顯微鏡(LEICA DM2500)，恒溫水浴箱(上海亞榮生物儀器廠)。

1.1.3 實驗動物 黑色豚鼠112只，體質量(250±20)g，雌雄各半，由南方醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.4 主要試劑 白靈片(佛山馮了性藥業有限公司生產，批號:100702)，氫醌(天津市天新精細化工開發中心，批號:20100120)，Dopa-氧化酶(Sigma公司)，鼠抗人酪氨酸酶單克隆抗體(Sigma公司)，DAB-H2O2(Sigma公司)，Elvision試劑(Sigma公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 黑色豚鼠112只，隨機分為正常對照組、模型組、陽性藥物對照組(給予白靈片1 128 mg·kg-1·d-1)，低、中、高劑量給藥組(分別給予驅白巴布期膠囊 580，1 160，2 320 mg·kg-1·d-1)，自身恢復組，中劑量預防組(給予驅白巴布期膠囊1 160 mg·kg-1·d-1)，每組雌雄各7只。

1.2.2 白癜風動物模型的建立 參考文獻［1］。脫去各組豚鼠背部黑色毛5 cm×5 cm，除正常對照組外，其他7組采用5%氫醌對黑色豚鼠進行皮膚脫色，正常對照組豚鼠每天涂抹等量0.9%氯化鈉溶液。連續涂抹30 d。在此期間，豚鼠每3 d在受試區脫毛1次。

1.2.3 給藥方法 正常對照組、模型組、自身恢復組不做任何處理，中劑量預防組從造模開始時給藥，連續給藥觀察60 d。其余各組造模30 d后開始給藥，連續觀察給藥30 d。

1.2.4 指標檢測 治療結束后，肉眼觀察各組藥物治療豚鼠實驗性白癜風的效果。于受試區中心取皮膚1 cm×1 cm，固定，石蠟包埋，切片后觀察黑素細胞，進行Dopa-氧化酶染色和Lillie染色觀察豚鼠表皮黑素細胞(melanocytes，MC)、含黑素顆粒基底細胞、酪氨酸酶含量變化。

1.3 酷氨酸酶強度判定標準 參考文獻［2］。酪氨酸酶陽性產物定位于細胞質內，顯鏡下細胞內出現黃色或棕黃色顆粒、或團塊狀為陽性表達。采用二級計分法判定結果，陽性細胞計＜5%為0分;～25%為1分;～50%為2分;～75%為3分;＞75%為4分。按染色強度分類:淡黃色1分;黃或深黃2分;褐或棕黃色3分。兩者相加＜2分為陰性(-)，2～3分為陽性(+)，4～5分為中等陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。

1.4 統計學方法 用SPSS軟件對實驗結果進行t檢驗統計學處理。組間計數資料比較均采用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統計意義。

2 結果

2.1 驅白巴布期膠囊對皮膚黑色素的影響 肉眼觀察可見，用5%氫醌后，各氫醌脫色組動物受試區皮膚較正常對照組動物受試區皮膚明顯偏白。其中模型組皮膚顏色最淡，呈蒼白色，有白斑，黑毛變成黃毛，有的甚至長出白毛。中劑量預防組動物皮膚較其他氫醌脫色組動物受試區皮膚偏黑。自身恢復組動物皮膚，較其他氫醌脫色組動物受試區皮膚偏白。高、中、低劑量給藥組、陽性對照組受試區皮膚肉眼觀察無明顯差別。

2.2 MC的觀察 Dopa-氧化酶染色后，棕黑色染色為黑素細胞陽性。分別于光鏡下測定每個高倍鏡視野內各組MC數量，每個標本觀察10個高倍鏡視野，計算每100個表皮基底細胞中MC的平均數量。見表1，圖1。

2.3 含黑素顆粒的基底細胞計數 Lillie染色后，黑色素呈暗綠色為陽性，分別于光鏡下測定各組含黑素顆粒的基底細胞數量，每個標本觀察10個高倍鏡視野，計算每100個表皮基底細胞中含黑素顆粒的基底細胞的平均數量。見表1，圖2。

表1 8組豚鼠表皮MC計數和含黑素顆粒基底細胞計數Fig．1 The count of epiderm alm elanocytes and basal cell containingmelanin granules of guinea pig in 8 groups%± s，n=14

表1 8組豚鼠表皮MC計數和含黑素顆粒基底細胞計數Fig．1 The count of epiderm alm elanocytes and basal cell containingmelanin granules of guinea pig in 8 groups%± s，n=14

與模型組比較，*1 P＜0.01;與中劑量給藥組比較，*2 P＜0.05;與正常對照組比較，*3 P＜0.05，*4 P＜0.01Compared with themodel group，*1 P＜0.01;Compared with themedium dose group，*2 P＜0.05;Compared with the normal control group，*3 P ＜0.05，*4 P ＜0.01

組別 給藥劑量/(mg·kg-1·d-1) 表皮MC 含黑素顆粒基底細胞驅白巴布期膠囊低劑量給藥組 580 26.1±3.2*1 24.7±2.1*1中劑量給藥組 1 160 27.0±2.6*1 28.5±5.0*1高劑量給藥組 2 320 33.8±4.3*1 37.1±2.2*1中劑量預防組 1 160 31.1±5.9*1*2 28.9±2.0*1陽性對照組 1 128 36.2±2.3*1 29.5±5.0*1自身恢復組 … 18.5±2.5 23.9±2.7*1模型組 … 14.6±2.2*3 21.0±1.0*4正常對照組 …42.2±2.5 43.1±3.2

2.4 酪氨酸酶含量觀察 見圖3，表2。

3 討論

白癜風是一種常見的色素障礙性皮膚病，臨床主要表現為黑色素減少或脫失。根據黑色素易受強氧化劑氫醌破壞的特點，參照文獻制備白癜風動物模型的方法［1］，選用性質更為穩定的5%氫醌將豚鼠黑色皮膚脫色，連續30 d后，肉眼可見豚鼠皮膚呈蒼白色，有白斑，黑毛變成黃毛，有的甚至長出白毛。鏡下可見皮膚切片，棘層和毛囊內黑色素減少，有的毛囊內上、中部黑色素完全脫失，而下部有少量黑素細胞，證明本實驗模型成功。

在成功制備了白癜風動物模型的基礎上，設置了自身恢復組、陽性對照組、中劑量預防組以及高、中、低劑量給藥組，通過連續30 d的治療，自身恢復組動物皮膚，較其他氫醌脫色組動物受試區皮膚偏白。高、中、低給藥劑量組、陽性對照藥物組受試區皮膚肉眼觀察無明顯差別。在組織學檢查中，給藥組表皮黑素分布及含黑素毛囊數明顯多于模型組(P＜0.01)，通過免疫組化結果，可發現，酪氨酸酶含量也明顯高于模型組(P＜0.01)，表明驅白巴布期膠囊在治療實驗性白癜風上的確是有效的。

在黑素細胞的黑素生物合成過程中，酪氨酸酶是黑素合成的關鍵酶，其活性決定著黑素合成的速度和產量。酪氨酸酶的表達定位于表皮基底部黑素細胞的細胞質，為黃或棕黃色顆粒，呈局灶性或彌漫性分布。本試驗顯示與模型組動物受試區皮膚相比，高、中、低劑量給藥組酪氨酸酶表達量明顯增加，預防給藥組動物皮膚受試區酪氨酸酶的表達含量同樣高出模型組，說明驅白巴布期膠囊對酪氨酸酶的表達有促進作用，驅白巴布期膠囊可能是通過對酪氨酸酶表達的上調作用治療白癜風。

圖3 8組酪氨酸酶強度光鏡圖(×400)A.模型組;B.自身恢復組;C.正常對照組;D.中劑量預防組;E.高劑量給藥組;F.中劑量給藥組;G.低劑量給藥組;H.陽性對照組Fig．3 The strength of tyrosinase under lightm icroscope(×400)A.Model group;B.Self-recovery group;C.Normal control group;D.Medium dose prevention group;E.High dose treated group;F.Medium dose treated group;G.Low dose treated group;H.Positive control group

表2 8組豚鼠酪氨酸酶強度結果Tab．2 The strength tyrosinase of guinea pig in 8 groups

驅白巴布期膠囊中所含的主藥為補骨脂和驅蟲斑鳩菊，補骨脂有致光敏作用，內服或者局部使用，使皮膚對紫外線照射敏感，容易出現色素沉著。補骨脂素和異補骨脂素促使皮膚黑色素的合成，并使之沉積于皮下，臨床上利用此作用來治療白癜風。現代藥理學研究表明，驅蟲斑鳩菊治療白癜風的作用機制是多方面的，可通過多途徑、多靶點發揮作用［3］。本實驗研究為臨床治療白癜風提供了一定的理論根據。

［1］ 張蘭蘭，閆明，劉曉東，等.兩種化學脫色劑對兩種動物模擬白癜風作用比較［J］.醫藥導報，2009，28(6):690-692.

［2］ 薛春雨，邢新，李蠡，等.酪氨酸酶在自體中厚移植皮片中的表達［J］.醫學研究生學報，2005，18(5):388.

［3］ 劉銅華，維藥驅蟲斑鳩菊治療白癜風的研究與應用［J］.國外醫學:中醫中藥分冊，2004，26(2):103.