體外人全血熱原實驗方法研究

何開勇，周素文，高華

(1.湖北省食品藥品監督檢驗研究院，武漢 430064;2.中國食品藥品檢定研究所，北京 100050)

非腸道給藥臨床使用已有100多年，關于藥物熱原的問題已經明確，無熱原是非腸道給藥的必備條件。家兔熱原檢查法能檢查出各種熱原，但不能定量和標準化，重復性比較差。細菌內毒素檢查法(bactaril endutoxin test，BET)具有經濟、快速、簡便、可定量、標準化等優點，但只能檢查細菌內毒素且受多種物質的干擾。體外人全血熱原實驗方法原理是基于人體發熱機制的一種體外試驗方法，通過檢測內熱原的含量可定量或定性反映樣品中所含各種熱原的質量，具有體外高靈敏度和寬檢測譜的優點。

1 材料與方法

1.1 主要材料 細菌內毒素國家標準品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號:981，效價:每支9 000 EU);脂磷 壁 酸 (lipoteichoicacid，LTA，Sigma公 司，批 號:085k4111);酵母多糖(Zymosan，Sigma公司，批號:045k1010;人白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6 及腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked Immuno-sorbent assay，ELISA)試劑盒，深圳晶美生物有限公司提供，批號:060525，061022，061206;定量鱟試劑，湛江安度斯生物有限公司，0710263;MCO-15AC型二氧化碳(CO2)培養箱(SANYO);Wellscsn MK2型酶標儀(Denley dragon);ZRY-2A智能熱原測定儀(天津大學無線電廠)。

1.2 方法

1.2.1 家兔熱原檢查法 挑選合格家兔隨機分成15組，測量兔的正常體溫，各組分別注射內毒素國家標準 品 (濃 度 分 別 為 2.0，1.0，0.5，0.25，0.125 EU·mL-1)，LTA(濃度分別為 2，1.0，0.5，0.25，0.125 μg·mL-1)，Zymosan(濃度分別為 64，32，16，8，4μg·mL-1)，注射體積均為10.0 mL·kg-1。注射后每15 min測量1次家兔體溫，共檢測300 min，以時間對體溫升高值作圖。樣品檢測按《中華人民共和國藥典》2010 年版［1］進行。

1.2.2 細菌內毒素檢查法(BET) 按《中華人民共和國藥典》2010 年版［1］進行實驗。

1.2.3 體外人全血熱原實驗方法

1.2.3.1 方法研究 健康獻血者至少1周沒有受病毒和細菌感染的，未服用對細胞因子產生影響的藥物，全血以10 U·mL-1肝素鈉抗凝。試驗采用無菌無熱原24孔組織培養板為載體，于每孔加氯化鈉注射液1 000μL、細菌內毒素標準品或空白對照品100μL、全血100μL［2］，細菌內毒素標準品序列濃度為0.25，0.5，1.0 EU·mL-1，空白對照品為細菌內毒素檢查用水，每一細菌內毒素標準品或空白對照品平行重復3孔，加畢振蕩混勻立即置于37℃、5%CO2培養箱中孵育，分別于 2，4，6，16，20，24 h 末取樣離心，取上清液100μL用ELISA 方法檢測 IL-1β、IL-6及 TNF-α 的含量，以時間對吸光度值作圖。

1.2.3.2 樣品檢測 檢測按WBT-IL-1β法進行，設計回收試驗組和供試品組，每組重復3孔?；厥赵囼灲M溶液制備:在供試品溶液中添加0.5 EU·mL-1的細菌內毒素標準品溶液，本次全血IL-1β的釋放量與LPS序列濃度的線性關系為CIL-1β=884.54CLPS-0.51，r=0.996，線性范圍0.03～0.5 EU·mL-1，通過樣品稀釋液及其回收試驗刺激全血釋放的IL-1β濃度平均值分別計算相當LPS濃度，并根據相當LPS濃度計算回收率，計算公式如下:回收率(%)=(回收試驗組LPS濃度-供試品組平均LPS濃度)/0.5×100%。參照《中華人民共和國藥典》［1］，回收率在50% ～200%范圍內認為樣品對系統無干擾，實驗有效。回收率若不符合要求，則繼續稀釋2，4，8，16 倍后試驗。

2 結果

2.1 家兔對LPS、LTA及Zymosan的熱原反應 結果見圖 1～3。家兔最大允許注射體積為10.0 mL·kg-1［1］，以此推斷家兔對內毒素國家標準品、LTA、Zymosan 3種熱原質的最低檢測濃度分別為0.5 EU·mL-1，0.5 μg·mL-1，16 μg·mL-1，LPS 致熱活性最強，LTA次之，Zymosan最弱。與文獻［3］報道一致。LPS、LTA及Zymosan使家兔發熱最高點分別在注射后90～105，120～135，195～210 min之間，依次延長。而現行家兔熱原檢查法檢測時間僅為180 min［1］，藥物如被Zymosan污染，現行家兔熱原檢查法不能有效檢測。LTA及Zymosan使家兔發熱至最高點后體溫下降速度比LPS慢，體溫升高狀態持續時間較長。

2.2 孵育時間對LPS濃度 梯度刺激全血釋放IL-1β、IL-6及TNF-α的影響實驗結果見圖4～6。各LPS梯度刺激IL-1β及IL-6分泌量在4 h最大，繼續孵育，分泌量較穩定，認為系統孵育時間4～24 h均可，國際合作確認組織推薦10～24 h［2］，考慮到對弱熱原質需要更長時間，為使反應充分及取樣時間的安排孵育時間定為20 h。0，0.25，0.5 EU·mL-1LPS梯度刺激IL-1β及IL-6分泌量在孵育4 h后有明顯差別，熱原質刺激人全血釋放的IL-1β分泌量明顯高于IL-6分泌量。但1.0 EU·mL-1刺激的分泌量對于0.5 EU·mL-1增加不大明顯，說明0.5 EU·mL-1刺激的分泌量已接近平臺期，且斜率在 0～0.5 EU·mL-1內最大。0.25 EU·mL-1組和0 EU·mL-1組分泌的TNF-α差異無統計學意義，說明0.25 EU·mL-1的LPS不能刺激系統釋放TNF-α，系統靈敏度低。0.5，1.0 EU·mL-1雖然能刺激系統產生TNF-α，但4 h達到最高點后持續下降，說明LPS刺激系統釋放TNF-α不太穩定，孵育時間對TNF-α釋放影響較大，系統耐用性不好，與人體試驗結果相一致［4］，人全血體外熱原試驗與人體對LPS的反應存在一致性。

2.3 3種 熱原試驗方法比較 對幾種樣品的檢測結果見表1。甘油果糖注射液最初家兔熱原檢查為不合格，用人全血-IL-1β法檢測為合格的邊緣產品，考慮到家兔對熱原質個體差異，故選取5只家兔按家兔熱原檢查復試的要求復檢，結果僅一只家兔體溫升高0.6℃，最后判斷該產品為合格產品。家兔個體差異大，對邊緣產品易造成誤判或漏判，人全血-IL-1β法可以克服這種缺陷，和BET一樣可以設置陽性、陰性對照組，具有可以標準化、定量的優點。甘油果糖注射液對鱟試劑和細菌內毒素的反應有抑制作用，不適用細菌內毒素檢查法，而對人全血-IL-1β法無干擾作用。凍干用狂犬病疫苗(vero細胞)因其免疫原性不適合家兔熱原試驗，臨床使用濃度對人全血-IL-1β法有干擾，回收率偏低，稀釋8倍以上可以克服干擾，4批樣品與BET比較結果一致均合格。人血清蛋白3種方法的結果一致均合格，回收率符合要求，對10批合格樣品的檢測符合率達到100%。

3 討論

現有熱原檢測方法有家兔法和鱟法(細菌內毒素檢查法)［1］。家兔法能檢查出各種熱原，但缺陷很多，如成本高等;對熱原的靈敏性受家兔的品系、年齡、實驗條件等限制;在注射最大允許體積(10 mL·kg-1)下，家兔法的檢測限在0.5～3.5 EU·mL-1，個體差異達到7倍，而人的發熱閾值為0.3 EU·mL-1，在家兔最低檢測限以下;因種屬不一樣并不能反映人體的發熱情況，即使經兔法檢驗合格的藥品也引起人體發熱反應;不能定量檢測，也不能得到統一標準，重復性比較差;同時很多藥品不適應家兔法，如對中樞和外周體溫調節機制有作用的藥物［5］。

表1 3種熱原檢測方法對幾種樣品的檢測結果

甘油果糖注射液對細菌內毒素檢查法有干擾，結果不成立;凍干狂犬疫苗法定檢查為細菌內毒素檢查法，不采用家兔法;“U”表示不符合規定;“Q”表示符合規定細菌內毒素檢查法經濟、快速、簡便、可定量、可標準化等，已替代80%家兔法檢測。但鱟作為一種遠古生物，并非取之不絕，BET法同樣存在倫理和動物保護以及在將來沒有足夠來源的問題。而且鱟試劑只能特異性地檢查革蘭陰性菌的內毒素，對其他熱原質表現為陰性，而除內毒素外有很多的物質對人和動物有潛在的致熱性［5］。

為彌補現有熱原檢查方法的不足，一種結合BET體外高靈敏度和家兔法寬檢測譜優點的新方法被提出來。人外周血單核細胞法由全血法發展而來，其實質為全血法的一種。在歐洲一共有6種方法系統被正式確認而向《歐洲藥典》推薦［6］。新的熱原試驗方法重復性好、靈敏度高、檢測譜廣、檢測限完全能滿足熱原檢查的要求，能夠替代傳統熱原試驗方法?！稓W洲藥典》已成立專家組對方法考察確認，美國、日本也在開展研究［6］。至今，對新的熱原試驗方法研究熱點趨勢是:早期的人全血法到人單核細胞系法，近期又轉向人全血法，認為全血法最能反映人體發熱反應，是最佳方法。

熱原檢查是非腸道給藥藥品生物安全性檢查的重要項目之一，有必要對此研究并吸收利用國際研究成果。經過多年的研究，全血法優勢明顯，是最有可能推廣應用的方法，故選擇此法進行研究、應用。在試驗中摸索出完成試驗所需條件及解決辦法，細化每一試驗步驟以求標準化，為擴大范圍的確認試驗作鋪墊。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2005:附錄99-102.

［2］ HOFFMANN S，PETERBAUER A，SCHINDLER S.International validation of novel pyrogen tests based on human monocytoid cells［J］.J Immunol Methods ，2005，298:161-145.

［3］ EPERON S，DE G D，WERNER F G，et al.Human monocytoid cell lines as indicators for endotoxin:comparison with rabbit pyrogen and limulus amoebocyte lysate assay［J］.J Immunol Methods，1997，207:135-145.

［4］ SUFFREDINIA F，HOCHSTEIN H D，GILBERT F，et al.Dose-related inflammatory effects of intravenous endotoxin in humans:evaluation of a new clinical lot of Escherichia coli O:113 endotoxin［J］.J Infect Dis，1999，179(5):1278-1282.

［5］ HARTUNG T，AABERGE I，BERTHOLD S，et al.Novel pyrogen tests based on the human fever reaction，the report and recommendations of ECVAM workshop 43，European centre for the validation of alternative methods［J］.Altern Lab Anim，2001，29:99-121.

［6］ HOFFMANN S，PETERBAUER A，SCHINDLER S.International validation of novel pyrogen tests based on human monocytoid cells［J］.J Immunol Methods，2005，298(6):161-173.