感覺神經末梢形態學研究方法及其在軀干和四肢軟組織中的研究進展

王永志(綜述)，李 麗(審校)

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院中醫科，北京100050)

神經形態知識的逐步深入，有賴于研究方法的不斷發展與改進，建立在中樞神經系統上的銀染法、免疫組化法和神經順行示蹤法等，同樣適用于針對感覺神經末梢(sensory nerve ending，SNE)的研究。這樣，在SNE形態學基礎上，研究者可以對軀體神經干、神經分支在其走行過程中，由于某些原因受到慢性損傷引起的局部疼痛、壓痛、感覺異常等系列神經功能障礙進行闡釋。

1 SNE分類

神經末梢一般是指周圍神經纖維軸突的終末，它分布于全身各種組織和器官中。神經末梢包括接受體表和內臟感覺傳入的SNE以及支配肌肉或腺體等效應器官的運動神經末梢。臨床上各種感覺的產生均來自于SNE，其形態結構不同，種類甚多，根據形態學觀點可將其歸結為游離的神經末稍和有被囊的神經末稍兩種［1］。

1.1 游離神經末稍 構成游離神經末稍的多是Aδ類及c類神經纖維。真皮內的神經纖維于不同深度反復分支，并失去髓鞘，形成裸露的軸突末稍，分布在表皮細胞之間，幾乎抵達角質層。每個末稍分布于表皮1至數毫米范圍，彼此重疊交錯，使皮膚具有很高的敏感性。筋膜、韌帶、骨膜、腦膜、肌鍵、關節囊等處也有游離神經末稍，一般認為它們大都是傷害感受器，各種不同性質的刺激達到一定強度，就成為傷害性刺激，都能引起痛覺。目前研究認為，這種與傷害刺激有關的游離神經末稍即是痛覺感受器。痛覺感受器在很多情況下是一種化學感受器，當組織受到損傷時，感受器周圍微環境的化學性質發生改變，例如，損傷組織釋放出組胺、5-羥色胺、緩激肽、前列腺素和鉀離子等各種致痛物質，作用于游離神經末稍，達到傷害性刺激的程度，從而引起傳入沖動，進入中樞神經系統，引起痛覺。

1.2 有被囊神經末稍 此類神經末梢包以結締組織成分組成被囊，種類很多，大小不一。它們大都有快適應的特點。目前研究比較多的有環層小體、觸覺小體、Ruffini小體和肌梭等。環層小體感受壓覺和震動覺，觸覺小體感受觸覺，Ruffini小體是一種機械感受器，而肌梭的功能則主要和肌肉活動相關。目前尚未發現這些感受器和疼痛有直接關系。

2 SNE形態學研究方法

在神經解剖學研究中，1903年西班牙人建了Cajal法［1］，首次顯示了神經元內的神經原纖維及軸突末梢，并因此榮獲諾貝爾獎。至20世紀末，各種研究方法層出不窮，神經末梢的研究作為分支之一，同樣適合用這些方法進行形態學的觀察。

2.1 Cajal法 1903 年的 Cajal法［1］，首次顯示末梢與其他神經元胞體間的連結不是連續的，而是接觸的，并由此建立了神經元學說，即神經元既是一個形態單位，又是一個功能單位。這個學說奠定了現代科學對神經系統研究的基礎。以后各改良方法相繼出現，Cajal吡啶銀染色法顯示神經原纖維、神經末梢及外周神經的再生過程效果良好，但也存在一定的不足［2］，如對標本的選擇要求非常嚴格，手術切除離體后，立即取材，同時浸入吡啶液固定，否則神經原纖維、神經末梢及周圍游離神經易于變性，影響其顯示。

2.2 潰變軸突與終末鍍銀法 1890年的Marchi法因其不能染軸突及其終末，潰變的時間有限，已被淘汰。1946年的Gless終末鍍銀法可發現終末前變性，是順行追蹤該核團的投射情況及終止區的獨到的方法，一直為神經解剖學研究者所使用。該方法的主要缺點是在核團損傷時，針道損傷的纖維也可染出，干擾了研究結果。因此自辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)法出現以后，近年來此法很少被應用。目前在銀染法中改良Bielschowsk神經末梢染色法較為理想，最大特點是在鏡下可控制其反應程度或效果。神經組織的浸染，最細的末梢也能清晰顯示出，而結締組織著色很淡［3］。

2.3 放射自顯影法 放射自顯影神經追蹤(autoradiographic nerve tracing，ARNT)法是20世紀60年代后期，Lasek等將放射自顯影術用于神經元投射途徑的研究時建立的。自從1972年 Cowan等首先用ARNT法研究中樞神經系統的纖維聯系以來，該法在神經科學界得到廣泛應用，逐漸成為追蹤神經纖維聯系的主要技術之一。該法的問世，是神經形態研究方面的又一創新。ARNT法基于軸漿運輸的機制。神經元的胞體都能合成蛋白質，并通過軸漿來運輸，胞體在合成蛋白質時，對氨基酸是有選擇性的攝取和運輸的。因此，用放射性核素標記的氨基酸，被胞體攝取合成蛋白質后沿著軸漿的運輸路徑可通過顯影來進行觀察。該種方法比較靈敏，最大優點就是不標記過路纖維，克服了HRP法和神經纖維潰變法標記過路纖維的缺點。但注射范圍小，對廣泛起源的通路不適用，而且需要較長時間才能觀察結果，若有偽像與錯誤不能及時得以校正，費時又費力，近年來也少被應用。

2.4 順行示蹤法 HRP示蹤法［4］:1971年，Kristenson和Olsson首先報道HRP可被神經末梢攝取，經軸漿逆行運輸至神經元胞體，然后用組織化學方法即可顯示出神經元的輪廓，從而創建了HRP追蹤神經元示蹤技術，即HRP法。HRP法的基礎是軸漿運輸，軸漿運輸是神經元的一項基本活動，即沿其軸突有從胞體向末梢(順向)及從末梢向胞體(逆向)的物質轉運。HRP法建立的早期，僅用于逆行追蹤，即將HRP注入神經的末梢部位，經逆行軸漿運輸至胞體，再通過酶組化染色顯示。以后的實驗證明，HRP也可用于順行運輸，即將HRP注入神經元胞體所在部位，HRP可順向運送至末梢部位。此后，為提高HRP本身的靈敏度而有一些結合HRP的產生，如麥芽凝集素結合HRP、霍亂毒素B結合HRP、去霍亂毒素結合HRP、菜豆凝集素結合HRP等。HRP方法的問世，在神經科學研究領域中極富價值，它結束了自Marchi(1886年)開始長達一個世紀的唯用銀染法追蹤潰變纖維的年代，在神經束路追蹤的形態及功能研究中具有劃時代的意義。至今，HRP追蹤技術已可運用于逆行追蹤、順行追蹤和跨節轉運。HRP的缺點是在中樞注射區有向周圍擴散現象，可采用微量注射或微電泳導入技術加以克服。而其究竟能被末梢攝取的有效范圍有多大，至今尚無十分準確的判斷標準。

葡聚糖是由腸系膜明串珠菌產生的多聚體，分子量有大有小，用于示蹤的葡聚糖相對分子質量一般為3×103。葡聚糖與不同的標志物結合形成各種追蹤劑。較常用的有四甲基羅達明葡聚糖胺和生物素葡聚糖胺(biotinylated-dextran amine，BDA)，兩者均可用于順行和逆行追蹤，但BDA的順行追蹤結果優于逆行追蹤。BDA與卵白素之間有特別強的親和力，常用結合了過氧化物酶或熒光素的卵白素與之孵育結合，通過組化反應或熒光顯微鏡觀察顯示標記結果。葡聚糖追蹤法的優點是:注射部位局限，動物存活時間較短，顯示反應程序簡單，靈敏度高，能進行多重順行追蹤標記。

2.5 熒光組織化學及免疫組織細胞化學法 1962年Falck-Hillarp發現了甲醛誘發熒光法，此法可使神經元內所含的單胺類物質與醛聚合成新的環形化合物，在熒光顯微鏡下發射出波長不同的熒光。用熒光顯微鏡觀察，兒茶酚胺末梢和細胞呈綠色熒光。5-羥色胺神經元及末梢呈黃色熒光。此法用甲醛蒸氣，需冷凍干燥裝置，比較麻煩。1972年瑞典學者Bjorklund和Lindvail創立乙醛酸誘發熒光法，手續簡便，也得到同樣效果。至今已有許多改良的技術，使該技術的敏感性和特異性大為提高。

20世紀70年代至今，免疫組織化學方法廣泛應用于神經解剖學的研究，它利用制備的特異性抗體血清(或單、多克隆抗體)與神經組織或細胞中相應的抗原結合。把相應的抗原諸如 PGP9.5［5，6］、降鈣素基因相關肽、P物質［7］等作為標志物，顯示不同功能的神經纖維陽性反應。此結合的顯示有直接法和間接法。直接法步驟簡便、特異性強、敏感性差。間接法顯示抗原抗體結合物的靈敏度高，一般用羊抗兔作為第二抗體與第一抗體上的抗原結合，或用熒光素與第二抗體結合，也可用靈敏度高的HRP或卵白素生物素過氧化物酶復合體與第二抗體結合，以顯示抗原抗體結合物在神經細胞體或其神經末梢的存在。

3 軀干四肢SNE形態學的研究

SNE廣泛分布于身體各個部位，本文僅對臨床上四肢和軀干易于發生軟組織疼痛的部位按解剖層次進行分述。

3.1 皮膚內 SNE 的研究 Cauna［8］應用 Bielscho wsky神經末梢染色法于光、電鏡下研究人手指皮膚游離神經末梢的精細形態，實驗未麻醉，于指部直接活檢取材。研究中見有大量形態不同的游離神經末梢分布于指部，光鏡下計數換算后每1 mm2約有各形態軸突末梢250個。末梢多垂直于皮膚表面，每一末梢支配一定表面區域，與臨近末梢不重疊，這樣的結構具備更好的精細觸覺和兩點辨別覺。這一點明顯不同于有毛皮皮膚的神經末梢分布。該方法的缺點是在材料的選擇上，對顯示游離神經末梢的選材以人的口唇或小白鼠上唇為好，觸覺小體的選材以人指尖掌側為好，這使得此方法有一定局限性，同時本方法不適于大批標本的制作［9］。

Marfurt等［10］通過在SD大鼠三叉神經節內注射HRP追蹤其順行運輸分布部位，在24～48 h內分別處死各組大鼠，常規組織取材，切片、四甲基聯苯胺顯色，光鏡下觀察。HRP可被運輸到各個神經末梢，在角膜、觸須毛囊、牙髓、牙周組織、面部皮膚均可見其蹤跡，在其軸突及末梢內比較密集，能夠清楚地顯示標記結構的位置和形態。Marfurt認為，本法標記后比較容易將神經纖維和末梢與其他組織區分，結果優于銀染法，因在銀染法下，由于其他組織，例如，網狀纖維或彈性纖維的嗜銀性，使得神經組織不易與之鑒別。在另一項研究再生神經纖維的分布的實驗中［11］，研究者采用CB-HRP順行示蹤技術，驗證再生纖維的來源和分布。實驗中行部分椎板切除術，顯露神經節，用玻璃顯微吸管將4 μL的2%CBHRP注入神經節，動物存活96 h，以甲醛混合液進行心臟灌注。取下神經節及移植皮瓣存于含10%蔗糖的磷酸緩沖液中12 h，冷凍切片，四甲基聯苯胺法進行呈色，光鏡下進行觀察。經1、2、4、6個月觀察證實失神經皮瓣獲得神經再支配是依賴植入的神經，而不是周圍皮膚內神經的長入。這種方法能區分粗大及纖細的神經纖維，而且由于將CB-HRP注射于脊髓背根節，因此可以了解外周皮膚某一區域內的神經末梢分布情況。

3.2 筋膜SNE的研究 在胸腰筋膜神經分布的研究中，Stilwell［12］發現，比較大的環層小體及類似環層小體的小團狀物和高爾基腱器官小體。而Hirsch等［13］僅觀察到精細的游離神經纖維和一些沒有被囊的末梢復合體。鑒于當時實驗條件限制，這些研究主要應用的是硝酸銀浸染及亞甲基藍染色，沒有能夠特異地對神經組織進行染色。

針對這種情況，Yahia等［14］在1992年應用免疫組織化學技術來研究胸腰筋膜神經分布，通過對神經絲蛋白及S100蛋白血清抗體免疫化學染色，對患者術后胸腰筋膜進行研究，光鏡下除發現游離神經末梢外，同時觀察到兩種機械感受器(Ruffini末梢及環層小體)，研究中對神經絲蛋白只觀察到陽性神經束，未見其他末梢小體結構，而針對S100蛋白抗血清則觀察到Ruffini末梢及環層小體。說明兩種不同的方法適用于不同的感覺神經組織結構。采用神經組織化學方法［15］，通過乙醛酸誘發熒光法對家兔頸椎前軟組織內腎上腺素能神經、膽堿能神經進行觀察。結果在椎前筋膜內觀察到腎上腺素能纖維有廣泛的分布;乙酰膽堿酯酶陽性纖維少量散在于其間。從形態學上證明頸椎前軟組織內存在大量的交感神經末梢。另一項研究中［16］采用放射性核素示蹤技術，對注入家兔頸后交感神經節的核素32P順行追蹤到頸椎前軟組織，觀察到交感神經有分支分布到頸椎前縱韌帶和椎前筋膜。

3.3 肌肉SNE的研究 肌組織中除肌張力感受器外，75%骨骼肌的感覺神經來自肌筋膜中的游離神經末梢，走行于肌纖維和血管之間，屬于有髓的Aδ和無髓的C纖維，是肌傷害感受器。Marina［17］觀察到機體的肌肉傷害感受器屬機械感受性，閾值低于肌痛閾。在小鼠皮大肌降鈣素基因相關肽免疫反應(calcitonin gene-related peptide immunoreactive，CGRP-IR)神經纖維分布的研究中［18］，針對小鼠皮膚進行整裝鋪片、石蠟切片、CGRP-IR卵白素-生物素-酶復合物染色法(ABC法)染色。光鏡下觀察，皮膚整裝鋪片上可見到真皮及皮大肌CGRP-IR神經纖維網，皮大肌的CGRP-IR神經纖維與肌纖維形成運動終板。應用Sihler染色法，觀察到家兔不同形態肌的肌內神經分支分布與肌纖維排列有關;肌內神經分支走行有與肌束平行和(或)垂直兩種形式［19］。Sihler染色法早年用于染肌梭，后經改良，目前已成為研究骨骼肌肌內神經的重要方法。其優點是在不損傷肌外形的情況下，清楚地顯示了原來肉眼不能見到的肌束與肌內神經分支的三維關系，為神經肌肉移植、電生理研究等提供了可靠的形態學依據［20］。

4 結語

目前對臨床中常見的各種軀干、四肢軟組織疼痛的研究，大多集中在血生化及電生理學等方面，而在組織學上，疼痛的感覺終器主要由感覺神經末稍引起，那么在病變后其形態學如何變化，目前在基礎研究中這一點備受關注。SNE形態的研究，大多建立在基本神經形態學研究方法之上。在具體研究中根據研究課題的需要，可以幾種方法結合，如銀染法、雙重熒光素標記或標記后又進行免疫組化反應、HRP法與免疫組化法結合等，這樣既能了解神經末梢分布情況，又可知道其細胞的化學性質，為闡明某一病變提供形態學基礎。

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