鮑曼不動桿菌的多重耐藥性與主動外排系統

劉嘉，申恒巧，劉漢清

(1.江蘇建康職業學院，南京210029;2.山東省淄博市婦幼保健院，255029;3.南京中醫藥大學，210029)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)是目前臨床上常見的非發酵革蘭陰性致病菌，其在免疫力低下的患者中，可以引起嚴重的感染，進而導致肺炎、傷口感染、敗血癥、腦膜炎、中耳炎、泌尿系感染等多種疾病［1］。根據最新國際醫院感染控制聯盟(International Nosocomial Infection Control Consortium，INICC)資料顯示［2］，鮑曼不動桿菌醫院感染日益增多，僅次于金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌，并且呈現多重耐藥現象，對許多臨床常用的抗菌藥物耐藥。GORDON等［3］總結了鮑曼不動桿菌的特點:①具有強的生存力和抵抗力;②廣泛耐藥和多重耐藥;③具有高定植率和傳染性。近年來，越來越多的研究證實鮑曼不動桿菌的多重耐藥性與其存在的能量依賴性主動外排系統相關，其中耐藥結節分化(resistance nodulation division，RND)超家族、易化子超家族(major facilitator super family，MFS)和多藥及毒物外排(multi-drug and toxic compound extrusion，MATE)家族是鮑曼不動桿菌中最重要的主動外排系統［4-5］。自2001年和2004年分別發現鮑曼不動桿菌的第一個RND外排系統AdeABCr73及其雙組分調節系統AdeRSE81以來，又陸續在不動桿菌中發現了AdeIJK、Tet和AbeM外排系統［3］。筆者就鮑曼不動桿菌的多重耐藥性與這些主動外排系統的關系綜述如下。

1 多重耐藥性與易化子超家族

MFS超家族是一個古老的進化產物，存在于細菌及真核生物中，可轉運糖類、生理代謝物及藥物，是目前已知最龐大的糖類和藥物的轉運體家族。MFS超家族是由400多個氨基酸殘基組成的12～14個跨膜α-螺旋結構，跨膜區(transmembrane section，TMS)存在許多高度保守的氨基酸序列，該區在其結構維持和功能發揮上有重要作用。

MFS類外排系統依賴質子泵動力把鮑曼不動桿菌內的藥物排到胞外，且通常與RND超家族和MATE家族形成轉運共同體，完成對多種抗菌藥物的外排［6］。MFS家族中與鮑曼不動桿菌多重耐藥性聯系最緊密的是Tet外排系統，Tet是鮑曼不動桿菌對四環素耐藥的主要機制之一。編碼Tet外排泵的基因有8種，其中，tetA～tetE存在于革蘭陰性菌，tetP僅限于梭菌屬，tetK和tetL則存在于革蘭陽性菌中。MARTI等［7］研究證實與鮑曼不動桿菌耐藥有關的Tet外排系統主要是TetA和TetB，TetA主要與鮑曼不動桿菌對四環素的耐藥有關，而TetB主要與鮑曼不動桿菌對四環素和米諾環素的耐藥有關，但這2個外排系統都不會導致鮑曼不動桿菌對新型抗菌藥物甘氨酰環素的耐藥。其檢測了79株耐四環素鮑曼不動桿菌的tetA和tetB基因發現，66%菌株攜帶tetB基因，而只有13.6%的菌株攜帶tetA基因。RIBERA等［8］發現在鮑曼不動桿菌中，編碼Tet外排蛋白的基因與編碼阻遏蛋白的基因常同時存在，這個系統受到環境中四環素的調控。當環境中不存在四環素時，阻遏蛋白可阻止結構基因的轉錄;當環境中存在四環素-Mg2+復合物時，可與阻遏蛋白結合，從而改變其構象，啟動結構基因的轉錄和表達，進而導致四環素耐藥。

2 多重耐藥性與耐藥結節分化超家族

RND超家族是革蘭陰性桿菌中最重要的主動外排系統之一，其是由內膜轉運蛋白、膜融合蛋白(membrane fusion proteins，MFP)和外膜通道蛋白(outer membrane protein，OMP)組成的三聯復合體。RND家族介導的主動外排是以質子跨膜濃度梯度作為外排動力的，即排出一個藥物分子的同時一個H+進入胞內［9］。目前，研究較多的與鮑曼不動桿菌的多重耐藥性相關的RND家族的主動外排系統有AdeABC、AdeIJK 及 AdeRS 3 種［6］。

2.1 AdeABC主動外排系統 AdeABC外排系統是第一個被發現的與鮑曼不動桿菌多重耐藥性密切相關的RND家族成員，其過度表達與氨基苷類抗菌藥物、β-內酰胺類抗菌藥物、氯霉素、琥乙紅霉素、四環素和溴乙錠耐藥有關［10］。AdeABC外排系統是由 AdeA、AdeB和AdeC共同組成的三聯體，其中AdeA是膜融合蛋白，AdeB是外排蛋白，AdeC是外膜通道蛋白。在外排過程中，AdeA起協調作用，可使細菌細胞內膜與細胞外膜更接近，并穩定OMP的結構。AdeB則從細胞內膜或細胞質中攝取底物，通過AdeC(OMP)轉運到細胞外。

adeABC基因位于鮑曼不動桿菌的染色體基因組中，其按照adeA，adeB，adeC的順序排列，他們朝同一方向轉錄，分別編碼 AdeA、AdeB和 AdeC蛋白。adeABC基因無論在敏感或耐藥株中均普遍存在，但在敏感菌株中卻不表達。關于adeABC基因與鮑曼不動桿菌多重耐藥關系的研究已有不少，林麗等［11］檢測了112株鮑曼不動桿菌臨床分離株的基因分布，在83.9%(94/112)的菌株檢測到adeABC基因，其中多重耐藥株占81.9%(77/94)，顯示出adeABC基因介導的AdeABC系統是導致鮑曼不動桿菌臨床分離株多重耐藥的重要主動外排系統。NEMEC等［12］分析了116株對奈替米星耐藥的鮑曼不動桿菌耐藥基因的表達，結果顯示有105株adeA及adeB表達呈陽性，而adeC的陽性表達率只有42.2%(49/116)。進而認為，adeC并非耐藥的實質因素，當其缺失時，AdeAB可能利用其他外膜成分實現對藥物的外排。

2.2 AdeRS調節系統 AdeRS屬于雙組分調節系統，AdeS和AdeR的關系與反應調節蛋白和感應激酶非常相似，AdeS可以感應環境條件的變化，活化(磷酸化)或鈍化(去磷酸化)AdeR蛋白，進而控制AdeABC外排系統的表達。MARCHAND等［13］經抗菌藥物誘導耐藥的試驗菌株中發現，正是由于位于adeA基因上游的調節基因adeR和adeS的基因突變，使外排泵基因adeABC表達，從而導致細菌的多重耐藥。他們對鮑曼不動桿菌BM4454的adeR、adeS基因分別進行插入失活，結果發現鮑曼不動桿菌恢復了對氨基苷類藥物的敏感性，其進一步的研究表明，adeR基因的116位Pro(脯氨酸，P)轉變成Lea(亮氨酸，L)以及adeS基因的153位Thr(蘇氨酸，T)轉變成Met(蛋氨酸，M)均可導致AdeABC系統高水平表達，進而導致多重耐藥。RUZIN等［14］在adeS基因前有插入序列ISAba1，使得adeABC過度表達，導致鮑曼不動桿菌對替加環素的MIC 增加至4 μg·mL-1。

2.3 AdeIJK主動外排系統 AdeIJK外排系統是由膜融合蛋白AdeI、外排蛋白AdeJ和外膜蛋白AdeK組成的三聯復合體，分別由 adeI、adeJ、adeK基因編碼。AdeIJK與AdeABC外排系統的結構及功能相似，AdeI蛋白促進細菌細胞內膜與細胞外膜的融合，AdeJ從細胞內膜或細胞質中攝取底物，通過AdeK轉運到胞外。AdeIJK對β-內酰胺類抗生素、氯霉素、四環素、氟喹諾酮類抗菌藥物和利福平等都有外排作用，且其過量表達對宿主具有毒性。DAMIER-PIOLLE等［15］認為AdeIJK外排系統的表達可能并不受特定調節，而受整體水平的調控。AdeIJK可能比AdeABC有更重要的生理學作用，可能與鮑曼不動桿菌固有耐藥部分相關。已有研究表明，鮑曼不動桿菌的耐藥株和相對敏感株同時存在AdeIJK，但多重耐藥株明顯高于相對敏感株，提示AdelJK可能與鮑曼不動桿菌固有耐藥相關［11］。

3 多重耐藥性與多藥及毒物外排家族

MATE家族是一個新的次級轉運蛋白家族，此類轉運蛋白對氨基葡糖、陽離子染料、多種抗菌藥物和藥物都有轉運作用。與鮑曼不動桿菌多重耐藥性有關的MATE家族外排系統是AbeM。AbeM蛋白和Tet一樣，是由質子介導的多藥外排系統，其由448個氨基酸組成，富含疏水氨基酸殘基，并有12個疏水性結構域。SU等［16］通過核酸序列比對發現AbeM蛋白與NorM(功能描述最好的MATE家族成員)具有同源性，并發現AbeM蛋白與銅綠假單胞菌PAO1株的PmpM蛋白、非01群霍亂弧菌的VcmA蛋白、大腸埃希菌的Ydh蛋白和流感嗜血菌的HmrM蛋白分別有39%，39%，37%，34%的一致性和77%，76%，76%，75%的相似性。研究還比較對了adeM基因插入失活前后的藥物敏感性最低抑菌濃度(MIC)值，突變株對諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星、慶大霉素、三氯生、吖啶黃、柔紅霉素、多柔比星、若丹明6G、溴化乙啶的MIC都降低了1/4以上;而對阿米卡星、紅霉素、氯霉素、甲氧芐啶降低了1/2。

4 結束語

隨著全球范圍內出現的鮑曼不動桿菌對亞胺培南耐藥性例數的增加，臨床抗菌藥使用已面臨著巨大的威脅，鮑曼不動桿菌也逐漸成為危害極大的“超級細菌”。鮑曼不動桿菌的耐藥機制非常復雜，除了與主動外排系統相關外，還牽涉到整合子，滅活酶、鈍化酶，外膜通透性改變等，到目前為止還有許多機制尚需進一步研究。筆者認為，對于藥學工作者而言，目前主要的研究任務應集中在兩個方面，即:①外排蛋白和抗菌藥之間的相互作用機制及具體調節通路;②新一代外排泵抑制藥的篩選和開發。總之，未來抗菌藥物設計原則應該考慮到外排系統的影響，同時需藥物外排泵抑制藥和能量抑制藥聯合應用，發揮抗菌藥物的最大效能，以提升鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的敏感性。

［1］RODRIGUEZ-BANO J，CISNEROS J M，FERNANDEZCUENCA G，et al.Clinical features and epidemiology of Acinetobacter baumanniicolonization and infection in Spanish hospital［J］.Infect Control Hosp Epidemiol，2004，25(10):819－824.

［2］ROSENTHAL V D，MAKI D G，JAMULITRAT S，et al.InternationalNosocomialInfection ControlConsortium(INICC)report，data summary for 2003-2008，issued June 2009［J］.Am J Infect Control，2010，38(2):95－104.

［3］GORDON N C，WAREHAM D W.Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii:mechanisms of virulence and resistance［J］.Int J Antimicrob Agents，2010，35(3):219－226.

［4］COYNE S，ROSENFELD N，LAMBERT T，et al.Overexpression of resistance-nodulation-cell division pump AdeFGH confersmultidrug resistance in Acinetobacter baumannii［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54(10):4389－4393.

［5］WASAZNIK A，GRINHOLC M，BIELAWSKI K P.Active efflux as the multidrug resistance mechanism［J］.Postepy Hig Med Dosw，2009，63:123－133.

［6］OPAZO A C，MELLA S M，DOMINGUEZ M Y，et al.Multi-drug efflux pumpsand antibiotic resistance in Acinetobacter baumannii［J］.Rev Chilena Infectol，2009，26(6):499－503.

［7］MARTI S，FERNANDEZ-CUENCA F，PASCUAL A，et al.Prevalence of the tetA and tetB genes as mechanisms of resistance to tetracycline andminocycline in Acinetobacter baumannii clinical isolates［J］.Enferm Infect Microbiol Clin，2006，24(2):77－80.

［8］RIBERA A，ROCA I，RUIZ J，et al.Partial characterization of a transposon containing the tet(A)determinant in a clinical isolate of Acinetobacter baumannii［J］.J Antimicrob Chemother，2003，52(3):477－480.

［9］ESWARAN J，KORONAKIS E，HIGGINS M K，et al.Three＇s company:component structures bring a closer view of tripartite drug efflux pumps［J］.Curr Opin Struct Biol，2004，14(6):741.

［10］PELEG A Y，ADAMS J，PATERSON D L.Tigecycline efflux as a mechanism for nonsusceptibility in Acinetobacter baumannii［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51(6):2055－2059.

［11］林麗，周岐新，凌保東.鮑曼不動桿菌主動外排系統AdeABC、AdeIJK與多重耐藥相關性［J］.中國抗生素雜志，2009，34(2):100－103.

［12］NEMEC A，MAIXNEROVA M，VAN DER REIJDEN TJ，et al.Relationship between the AdeABC efflux system gene content，netilmicin susceptibility and multidrug resistance in a geno-typically diverse collection of Acinetobacter baumannii strains［J］.J Antimicrob Chemother，2007，60(3):483－489.

［13］MARCHAND I，DAMIER-PIOLLE L，COURVALIN P，et al.Expression of the RND-type efflux pump AdeABC in Acinetobacter baumannii is regulated by the AdeRS twocomponent system［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48(9):3298－3304.

［14］RUZIN A，KEENEY D，BRADFORD PA.AdeABC multidrug efflux pump is associated with decreased susceptibility to tigecycline in Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex［J］.J Antimicrob Chemother，2007，59(5):1001－1004.

［15］DAMIER-PIOLLE L，MAGNET S，BREMONT S，et al.Adeijk，a resistance-nodulation-cell division pump effluxing multiple antibiotics in Acinetobacter baumannii［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52(2):557－562.

［16］SU X Z，CHEN J，MIZUSHIMA T，et al.AbeM，an H+-coupled multidrug efflux pump belonging to the MATE family of transporters，from Acinetobacter baumannii［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49(10):4362－4364.