PCR技術在呼吸道病毒檢測中的應用進展

石 晶（綜述），孔曉慧（審校）

（首都醫科大學附屬北京兒童醫院兒科研究所免疫室，北京 100045）

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）自從問世以來，經過幾十年的發展，其在各項領域中的作用已愈顯重要，特別是在各種病毒的快速準確檢測中，更是以往的傳統檢測方法所不能比擬的。PCR的基本過程類似于DNA的天然復制，特異性依賴于靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。整個過程由變性-退火-延伸3個基本反應步驟構成。通常，每完成一個循環需時2～4 min，2～3 h就能將靶核苷酸擴增放大幾百萬倍［1］。目前的PCR技術已有十幾種，每種都有其優缺點，下面對各種PCR技術在病毒檢測中的應用作簡要綜述。

1 反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcript PCR，RT-PCR）

RT-PCR是提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用反轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的敏感度提高了幾個數量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用于:分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。采用敏感性較高的RT-PCR方法，總的病毒檢出率提高，且檢測的病毒種類比較多，對目前報道的可引起兒童呼吸道感染的9種常見病毒病原包括新發現的人類博卡病毒均能進行檢測［2］。

2 PCR-免疫

在常規的分子生物學中，對PCR擴增的產物的分析主要是采用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察、拍照。這種方法簡單經濟，但是其缺點是存在假陰性、假陽性，溴化乙錠污染環境，紫外線傷害人體，只能進行定性或半定量分析，不能準確定量［3］。目前發展的 PCR-免疫，即用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法來檢測并定量PCR產物已經解決了這個問題。PCR-免疫技術包括被測目的DNA的PCR擴增和PCR產物的檢測兩部分。它主要是用一對分別標記了生物素和捕獲抗體固定擴增產物，用標記上堿性磷酸酶的抗地高辛抗體進行雙抗夾心ELISA。與凝膠電泳、EB顯色相比，ELISA方法檢測定量PCR擴增產物結果具有更高的穩定性和可重復性。凝膠電泳、EB顯色的變異系數（CV）達到38%，而ELISA的變異系數只有10%。而且，以熒光染料AttoPhos作為顯色底物的ELISA檢測敏感度比凝膠電泳、EB顯色高10倍。另外，熒光強度和抗原檢測量的相關系數也高達99%。這種PCRELISA更節省時間，且易于自動化操作和便于臨床檢測。它也為病毒的早期檢測提供了一個可行的平臺，因為它需要的樣本量很小［4］。國際上免疫PCR技術近兩年發展很快，主要用于檢測體內激素、腫瘤、病毒、細菌、支原體、衣原體等［5］，它作為一種抗原檢測系統，同時具有抗原抗體反應的特異性和PCR的高敏感性、適合于各種微量抗原的檢測，并且可以直接檢測細胞上的抗原。

3 實時熒光定量RT-PCR

所謂實時熒光定量RT-PCR技術，是指在反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時檢測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的一種方法。在傳統的PCR中，通常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應的最終產物，因此用此終點法對PCR定量存在不足之處。在實時熒光定量RT-PCR中，對整個PCR反應擴增產物過程進行了實時的監測和連續的分析擴增相關的熒光信號，隨著反應的進行，監測到的熒光信號變化可以匯成一條曲線，在PCR反應的早期，產生的熒光的水平不能與背景明顯地區別，而后熒光的產生進入指數期、線性期和最后的平臺期，因此可以在PCR反應處于指數期的某一點上來檢測PCR產生的量，并且由此來推斷模板最初的量。實時熒光的應用很廣泛，包括mRNA表達的研究、DNA拷貝數的檢測、單核苷酸多態性的測定等，它是一種常規的能分析病毒核苷酸特性的檢測方法［6］。張萍等［7］對617份流感病毒標本進行檢測，其中實時熒光定量RT-PCR檢測陽性152份，陽性率為24.64%;犬腎傳代細胞細胞培養法分離流感病毒79株，陽性率為12.80%。兩者的陽性率差異有統計學意義。因此，實時熒光定量RT-PCR和細胞培養方法檢測流感病毒具有一致的特異性。實時熒光定量RT-PCR可作為一種快速有效的流感病毒核酸檢測法，適用于公共衛生應急疫情的實驗室快速診斷。胡曉武等［8］以甲型流感病毒特異M基因的保守區為靶區域設計特異引物和TaqMan熒光探針，建立一步法實時熒光定量RT-PCR方法，并對乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒Long株、冠狀病毒OC43及229E、副流感病毒（1、2、3型）以及季節性流感病毒（H1、H3）進行檢測，得出一步法實時熒光定量RT-PCR可對甲型流感病毒進行特異擴增，操作方便快速，對H1和H3亞型的最低檢出限可達0.01 TCID 50/mL;對384例臨床咽拭子樣本的檢測準確度達99.5%，一步法實時熒光RT-PCR方法可實現對甲型流感病毒快速準確的檢測，有助于對臨床流感病例的快速診斷。與其他檢測技術相比，實時熒光定量PCR的敏感度分別是病毒分離培養的10倍，常規 RT-PCR的30～40倍。實時熒光PCR技術與其他分子生物學技術相結合使定量極微量的基因表達或DNA拷貝成為可能，但是與傳統的PCR技術相比，實時熒光定量PCR也有不足之處:①由于運用了封閉的檢測，減少了擴增后的電泳的檢測步驟，因此也就不能監測擴增產物的大小;②實時熒光PCR因為熒光種類及光源的局限性，相對地限制了多重檢測得能力;③目前此項技術的成本較高［9］。

4 多重PCR

多重PCR（multiplex PCR，又稱多重引物PCR或復合PCR），是在同一PCR反應體系里加入兩對或兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理、反應試劑和操作過程與一般PCR相同。多重PCR技術已被廣泛應用于核酸診斷的許多領域，包括基因剔除分析、突變和多態性分析、定量分析及RNA檢測等。在感染性疾病領域，多重PCR技術已經顯示出它的價值，成為識別病毒、細菌、真菌和寄生蟲的有效方法。一次多重PCR反應可同時檢測、鑒別出多種病原體，在臨床混合感染的鑒別診斷上具有其獨特的優勢和很高的實用價值［10］。當前多重PCR在病原微生物的檢測方面應用最為廣泛。雖然多重PCR檢測方法僅為定性檢測，但其發展較為成熟，在保持了較高特異性和敏感度的同時，研制周期和成本明顯低于實時熒光定量PCR和基因芯片，實驗步驟簡單，檢測時間短，有利于在臨床廣泛應用。

5 多重PCR技術為基礎的反式線點雜交（multiplex PCR-based reverse line blot hybridization，mPCR/RLB）

北京兒童醫院［11］利用mPCR/RLB檢測7種病毒株，均得到相應的目標擴增產物，擴增條帶清晰，與目標片段一致。且7種病毒株:人流感病毒（A、B型）、人副流感病毒（1、2、3 型）、人腺病毒（Adv）、呼吸道合胞病毒（RSV）RLB雜交均得到清晰的雜交模式，并且彼此之間沒有交叉反應。與作為陽性對照的細菌標準菌株亦沒有交叉反應。RLB方法的敏感度比PCR高10～100倍，任何一種毒株間均沒有交叉反應，7種病毒株同時與作為陽性對照的細菌標準菌株均沒有交叉反應，顯示了特異的雜交模式。延長免疫印記底物曝光時間至過夜，同樣沒有交叉反應。同一張膜重復進行實驗，檢測結果完全一致，雜交信號無減弱現象。mPCR/RLB是方便、客觀的檢測方法，它能同時從43個不同標本中檢測到43個目標基因，它的靈活性要比DNA微陣列高，并且還便宜［12］。mPCR/RLB所需 DNA 量少，儀器簡單，雜交膜可重復利用，每張膜可重復使用15～20次，大大降低了每份標本的檢測費用。同一份標本可多次重復，雜交結果穩定，可重復性好。本法具備了簡單、經濟而且靈活等特點，適合混合感染和需要較高培養要求的病原體的檢測［13］，一次檢測標本數可多達43份，適合對臨床標本進行高通量檢測。

6 多重實時熒光RT-PCR

多重實時熒光RT-PCR的實質是指在一個反應管中加入針對多種基因的引物和不同標志物標記的探針（通常為可發出不同波長熒光的基團），以對多重目標基因同時進行擴增和檢測。該方法在呼吸道疾病病原體的診斷中有廣闊的應用前景［14］。多重實時PCR技術核酸擴增和檢測在同一反應密封管中同時進行，具有敏感度高、特異性強、準確快速的特點，但是其引物和探針設計較為困難，并且需要具備多通道檢測能力的實時熒光PCR儀。Chen等［15］用實時熒光技術在同一個檢測管里檢測新型HINI-2009病毒和季節性H3N2病毒、流感病毒B和呼吸道合胞病毒，其檢測靈敏度和特異度分別為99%和100%。Hymas等［16］用三重實時熒光PCR檢測流感病毒A、流感病毒B和呼吸道合胞病毒，與疾病控制中心的結果對比，流感病毒A的檢出率是100%，此技術有99%的符合率。對流感病毒的檢出限制在750～1500個拷貝之間，并且與其他呼吸道病之間沒有交叉反應。多重實時熒光RT-PCR與病毒培養或免疫熒光相比有96.5%的特異性和98.0%的靈敏度［17］。當冬季流感病毒和呼吸道合胞病毒一起傳播的時候，這種方法對病毒的同時檢測很有用［18］。但是，該方法在臨床診斷中最大的障礙是:如何能保證在同一反應體系中，針對每一病原體的PCR的特異性和敏感性都能達到臨床的檢測要求。

7 反轉錄為基礎的電噴霧電離質譜技術（multi-locus RT-PCR followed by electrospray ionization mass spectrometry，RT-PCR/ESⅠ-MS）

RT-PCR/ESI-MS結合了反轉錄和質譜分析的優點，它是一種高通量的核酸依賴技術，能精確地測出PCR擴增產物的量。這種技術首先用于微生物的鑒定和確定分型，后來又應用于流感病毒的檢測和鑒定［19］，它使呼吸道病毒的快速診斷成為可能［20］。檢測呼吸道病毒的RT-PCR/ESI-MS能一次性檢測出呼吸道合胞病毒，如流感病毒A、B，1～4型的副流感病毒、腺病毒、冠狀病毒和人偏肺病毒等多種病毒。Chen等［21］通過對2007～2008年呼吸急診室中的患者檢測發現，RT-PCR/ESI-MS的靈敏度和特異度分別是89.1%和80.3%，在傳統檢測方法中不能被檢測到的病毒也被檢測到。此種技術的功能在呼吸道病毒的檢測中是明確的。

8 環介導的反轉錄等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

LAMP是近年來發展出來的一種核酸擴增技術。通過設計識別目的片段6個序列的4個特異引物，整個反應可以在恒溫（60～65℃）條件下1 h內完成，由于采用4個引物，與傳統的核酸擴增技術相比，LAMP簡化了94℃變性的步驟，同時退火和延伸在同一溫度條件下進行，整個擴增反應歷時短，一般為30～60 min即可判斷結果。Le等［22］結合RNA的快速提取和RT-LAMP，9種目的病毒都能在2 h之內檢測到，這種檢測技術的敏感性比一步RT-PCR要高或與之相同，并且，有兩種病毒不光在感染的病例中被檢測到，在昆蟲的攜帶者中也有檢測到。它具有敏感、特異的特點;且產物中有大量的副產物——白色焦磷酸鎂沉淀，擴增產物可通過肉眼觀察或濁度計即可判定結果;反應不需要精密控溫設備和高級復雜的分析儀器，對操作人員的熟練度和專業水平要求不高，因此該方法特別適合基層或者實驗條件較差的試驗室進行病原微生物的快速檢測［23］。

9 擴增片段長度多態性分析（amplified fragment length polymorphism，AFLP）

AFLP技術是一項新的分子標記技術，是基于PCR技術擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結合位點。限制性片段用兩種酶切割產生，一種是罕見切割酶，另一種是常用切割酶。它結合了限制性片段長度多態性和PCR技術特點，具有限制性片段長度多態性技術的可靠性和PCR技術的高效性。由于AFLP擴增可使某一品種出現特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產生，因此，這種通過引物誘導及DNA擴增后得到的DNA多態性可作為一種分子標記。AFLP具有可靠性好，重復性強，可信度高等優點。de Vries等［24］通過調整反轉錄酶和降低rRNA的復制優化了AFLP技術，使其明顯地增強了反應的敏感性，也提供了一種可行的直接從患者的物體上檢測到病毒的方法。

呼吸道病毒是一組能夠通過呼吸道傳播引起呼吸系統或及其他系統疾病的病原微生物。呼吸道病毒傳染性強，可以引起局部暴發和世界大范圍流行，嚴重影響人類健康。由于呼吸道致病微生物感染臨床癥狀相似，影像學表現缺乏特異性，因此病原學證據在臨床診斷和流行病監控中十分重要，由于傳統病毒診斷技術存在明顯缺陷，其在臨床中的應用受限。隨著分子生物學的進步，特別是PCR技術的發展為呼吸道病毒的鑒定與分型提供了新的選擇。PCR反應中根據病毒保守序列設計引物，并可對微量模板（pg水平）進行指數級擴增，是簡便、快速、敏感、特異性強的病毒檢測方法。正如有人提到的，最初PCR的出現，并不是為了解決某一個特定的難題，PCR出現后，各種各樣的需要PCR方法才能解決的問題，就不斷出現。

［1］李金明.實時熒光 PCR技術［M］.北京:人民軍醫出版社，2007:1-3.

［2］劉春艷，謝正德，Richard G.兒童急性下呼吸道感染病毒病原學研究［J］.中國實用兒科雜志，2009，24（4）:270-272.

［3］馮仁青，郭振泉，宓捷波.現代抗體技術及其應用［M］.北京:北京大學出版社，2006:171.

［4］Perez JW，Vargis EA，Russ PK，et al.Detection of respiratory syncytial virus using nanoparticle amplified immuno-polymerase chain reaction［J］.Anal Biochem，2011，410（1）:141-148.

［5］楊葵，周棱，王衍真.雙抗夾心免疫PCR法檢測人促甲狀腺激素（TSH）［J］.免疫學雜志，2000，2（16）:27-29.

［6］Hopkins MJ，Moorcroft JF，Correia JB，et al.Using the full spectral capacity（six channels）of a real-time PCR instrument can simplify diagnostic laboratory screening and typing protocols for pandemic H1N1 influenza［J］.Influenza Other Respi Viruses，2011，5（2）:110-114.

［7］張萍，韓文清，宮連鳳.實時熒光RT-PCR與細胞培養法在流感病毒檢測中的應用［J］.中國病原生物學雜志，2011，6（1）:45-47.

［8］胡曉武，周紅艷，沈佐君，等.一步法實時熒光RT-PCR在快速檢測甲型流感病毒中的應用［J］.臨床輸血與檢驗，2010，12（4）:296-298.

［9］張蓓.實時熒光PCR的應用［J］.國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊，2003，24（6）:327-329.

［10］Marinheiro JC，Sanalios RB，Santos DC，et al.Duplex-PCR assay for the detection of adenovirus and respiratory syncytial virus in nasopharyngeal samples［J］.Mem Inst Oswaldo Cruz，2009，104（1）:118-120.

［11］邵芳，王亞娟.多重聚合酶鏈反應和反向線性點雜交技術在常見呼吸道病毒檢測中的應用［J］.山東醫藥，2010，50（52）:22-24.

［12］Fanrong K，Gwendolyn LG.Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay（mPCR/RLB）-a practical epidemiological and diagnostic tool［J］.Nat Protoc，2007，11（1）:404.

［13］Wang YJ，Kong FR，Yang YH，et al.A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization（mPCR/RLB）assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia［J］.Pediatr Pulmonol，2008，43（2）:150.

［14］莽克強，Marcel B，Rui M.基礎病毒學［M］.北京:化學工業出版社，2005:46-47.

［15］Chen Y，Perez JW，Vargis EA，et al.Detection of respiratory syncytial virus using nanoparticle amplified immune-polymerase chain reaction［J］.Anal Biochem，2011，26（2）:124-126.

［16］Hymas WC，Mills A，Ferguson S，et al.Development of a multiplex real-time RT-PCR assay for detection of influenza A，influenza B，RSV and typing of the 2009-H1N1 influenza virus［J］.J Virol Methods，2010，167（2）:113-118.

［17］Jannetto PJ，Buchan BW，Vaughan KA.Real-time detection of influenza A，influenza B，and respiratory syncytial virus A and B in respiratory specimens by use of nanoparticle probes［J］.J Clin Microbiol，2010，48（11）:3997-4002.

［18］Papillard-Marechal S，Enouf V，Schnuriger A，et al.Monitoring epidemic viral respiratory infections using one-step real-Time Triplex RT-PCR targeting influenza A and B viruses and respiratory syncytial virus［J］.J Med Virol，2011，83（4）:694-701.

［19］Deyde VM，Sampath R，Gubareva LV，et al.RT-PCR/electrospray ionization mass spectrometry approach in detection and characterization of influenza viruses［J］.Expert Rev Mol Diagn，2011，11（1）:41-52.

［20］Chen KF，Blyn L，Rothman RE.Reverse transcription polymerase chain reaction and electrospray ionization mass spectrometry for identifying acute viral upper respiratory tract infections［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2011，69（2）:179-186.

［21］Chen KF，Rothman RE，Ramachandran P，et al.Rapid identification viruses from nasal pharyngeal aspirates in acute viral respiratory infections by RT-PCR and electrospray ionization mass spectrometry［J］.J Virol Methods，2011，173（1）:60-66.

［22］Le DT，Netsu O，Uehara-Ichiki T，et al.Molecular detection of nine rice viruses by a reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification assay［J］.J Virol Methods，2010，170（1）:90-93.

［23］邵軍軍，常惠蕓.環介導等溫擴增技術及其在分子診斷中的應用［J］.實用診斷與治療，2007，21（6）:450-453.

［24］de Vries M，Deijs M，Canuti M，et al.A sensitive assay for virus discovery in respiratory clinical samples［J］.PLoS One，2011，6（1）:e16118.