間充質干細胞的衰老與系統性紅斑狼瘡的研究進展

戴 林，姜津霞(綜述)，曹曉蕾，顧志峰(審校)

(1.南通大學附屬醫院風濕免疫科，江蘇南通226001;2.南通大學醫學院病理教研室，江蘇南通226001)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有體外高度擴增、多向分化、支持造血、免疫調節及誘導免疫耐受能力的多能干細胞。其組織器官的維持和再生作用越來越成為研究的熱點。但是，由于培養代數的增多及疾病的原因，MSCs會逐漸出現衰老。MSCs的衰老與疾病之間的關系日益受到重視。但MSCs的衰老及機制目前尚未完全明了?，F就MSCs衰老的研究進展及與系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的關系予以綜述。

1 MSCs的生物學特性及免疫學特性

MSCs來源廣泛，可來源于骨髓、肺臟等多種組織器官，體外具有很強的擴增能力，且仍然保持穩定的表型和多向分化的潛能。MSCs表面標志白細胞分化抗原、基質細胞抗原陽性，造血譜系標記陰性。目前認為 MSCs標志物 CD166、CD105、CD44等標記陽性，CD34、CD45、CD14等造血譜系標記陰性，結合 MSCs向骨、脂肪、軟骨等分化及貼壁生長的特性可以判斷為 MSCs［1，2］。

MSCs具有誘導免疫耐受和免疫抑制的特性。研究表明［3］，干擾素γ可上調主要組織相容性抗原復合物Ⅰ類分子表達，并可誘導主要組織相容性抗原復合物Ⅱ類分子的表達，而不改變協同刺激分子的表達。MSCs由于缺乏協同刺激分子不能產生第二信號，將導致T淋巴細胞無能，從而可誘導免疫耐受。即使加入干擾素γ誘導了主要組織相容性抗原復合物Ⅱ類分子的表達，也不能刺激同種異體反應，說明MSCs無免疫原性，能誘導免疫耐受。

MSCs能抑制混合淋巴細胞反應中的T細胞增殖，包括同種異基因抗原和絲裂原引起的T細胞增殖，且這種抑制作用不受主要組織相容性抗原復合物限制。MSCs可在體外抑制細胞毒性淋巴細胞的產生，并可逃避細胞毒性淋巴細胞和自然殺傷細胞的殺傷作用。MSCs可延長異體皮膚移植存活率。腫瘤細胞植入異體小鼠時，腫瘤細胞會被宿主免疫系統清除，當腫瘤細胞和MSCs同時注入異體小鼠后，腫瘤細胞可在受體內存活，表明MSCs在體內外具有免疫抑制功能。

2 MSCs衰老的改變及特征

衰老的細胞往往表現為細胞周期抑制蛋白(如p53/p21、p16/Rb蛋白)的表達上調、不可逆的G1期生長停滯、細胞體積增大、衰老相關的β-半乳糖苷酶(senescence associated β-galactosidas，SA-β-Gal)活性增加、分化能力異常。

Sethe等［4］認為衰老的 MSCs往往具有以下改變:①擴增速度減慢，數量減少;②分化能力、再生能力等功能改變;③遷移能力改變。

衰老的MSCs往往具有以下特征:①細胞體積增大、肌動蛋白應力纖維改變;②細胞集落數下降、細胞的增殖潛能改變;③分化能力的改變;④生長曲線變慢;⑤端粒、端粒酶活性改變;⑥SA-β-Gal活性增加;⑦超微結構改變;⑧分泌細胞因子異常;⑨調節細胞生物學行為(如細胞周期、DNA損傷后修復及有絲分裂等)相關基因的表達變化［4，5］。

2.1 衰老MSCs的形態 研究表明［6］，衰老的MSCs體積增大、細胞扁平、核變大;纖維狀梭形細胞的比例逐漸減少，而多角形、星形細胞的比例增加;觸角增多，胞質變多而且充滿細小的顆粒甚至空泡，折光度差，黏附能力增加。衰老的MSCs含有肌動蛋白應力纖維增多。老年人MSCs在體外培養時，紡錘體型MSCs數目減少。MSCs轉染了肉瘤病毒40或人端粒酶反轉錄酶后，細胞表現為永生化，體積較轉染前明顯減少。這也提示衰老MSCs體積增大。

2.2 衰老MSCs的增殖潛能 細胞在體外培養中的傳代次數反映了細胞的增殖能力。研究表明，老齡鼠骨髓MSCs成纖維細胞集落生成單位形成減少。Baxter等［7］研究表明，MSCs的增殖能力隨著年齡的增加而下降，取自年老個體的MSCs在體外傳代的次數明顯低于年輕個體。但也有一些研究未發現類似的變化。這些研究差異可能與MSCs的培養環境有關。

2.3 衰老MSCs的分化能力 目前有關衰老MSCs的分化研究大多集中在向成骨和脂肪分化能力的研究。研究表明［4］，衰老MSCs向成骨細胞分化的百分率隨著年齡的增加而下降，提示向成骨分化總體能力的降低。Bonab等［8］的研究顯示，骨髓MSCs向脂肪轉化的能力隨著年齡的增加而增強。有學者將這種成骨轉化能力的減低和脂肪轉換能力的增強稱之為脂肪轉換，但該研究結果存在一定爭議。Shi等［9］研究不同年齡段兔的脂肪MSCs的成骨分化能力，未發現在成骨細胞分化方面存在差異。Muraglia等［10］通過對185例骨髓MSCs進行分化研究，發現MSCs的單項分化能力并不存在年齡差異，但是年輕供體MSCs的雙向或者三向分化能力要強于年老者。這也提示，隨著年齡的增加骨髓MSCs的分化潛能確有某種程度或某個方面的減弱。然而，該研究并未發現MSCs的脂肪分化能力隨著增齡而增加。Park等［11］的研究提示，MSCs的脂肪分化能力下降與細胞的小窩蛋白1表達增加有關。但總的研究表明，隨著MSCs的衰老，MSCs的分化潛能有下降趨勢。

2.4 衰老MSCs的生長曲線 由于接種密度的不同，MSCs分裂成雙倍細胞的時間為 12～24 h。Baxter等［7］研究表明，老年個體來源的 MSCs生長速率較來源于年輕個體的MSCs明顯下降。

2.5 衰老MSCs的端粒及端粒酶 當端粒到達一定長度時，細胞停止分裂進入細胞衰老。Baxter等［7］研究表明，MSCs以每年17 bp的速率縮短，在體外培養時，端粒長度的縮短速率為每世代縮短30～120 bp，但是其他的研究小組存在不同的結論。

研究表明［12］，端粒酶的活性與 MSCs的分化功能相關。腫瘤細胞、胚胎細胞、胚胎干細胞、造血干細胞等干細胞的端粒酶處于活化狀態，體細胞端粒酶則處于失活狀態。有關MSCs是否表達端粒酶還存在一定爭議。這可能與端粒酶的測定方法和不同的判定標準有關。有學者認為表達端粒酶活性的MSCs可能是 MSCs的一個亞型。Shi等［13］研究表明，端粒酶的持續表達能促進MSCs細胞壽命的延長及分化能力的增強。Liu等［14］研究發現，端粒酶剔除的小鼠MSCs顯示早衰的征象。

2.6 衰老 MSCs 中 SA-β-Gal的表達 SA-β-Gal是衰老細胞的標志酶，體外培養的人二倍體成纖維細胞SA-β-Gal染色陽性率隨代齡增加而增加，老年皮膚SA-β-Gal染色陽性率高于年輕個體，提示SA-β-Gal是體內外細胞衰老研究的標志。Vacanti等［15］研究發現，豬MSCs隨著培養代數的增多，SA-β-Gal表達增加。該研究的類似結果被Park等［11］在人MSCs中加以證實，并伴有p53和p16/Rb表達的增加。Stenderup 等［16］研究發現，SA-β-Gal活性在末代培養的MSCs表達明顯增加，但在不同年齡供體的MSCs中未發現SA-β-Gal活性表達的差異與年齡相關。

2.7 衰老MSCs分泌細胞因子的異常 衰老相關的功能改變還包括分泌激酶、細胞因子、生長因子的變化，從而通過調節組織微環境而改變組織功能。Moerman等［17］研究表明，年老供體MSCs分泌轉化生長因子 β(transforming growth factor β，TGF-β)的能力下降。Tsuboi等［18］在早衰鼠MSCs的研究中也發現類似結果。骨形成蛋白2/4對于成骨細胞的成熟具有十分重要的作用。研究表明，衰老 MSCs分泌TGF-β、骨形成蛋白2/4的能力下降，這可能與向成脂肪轉化有關［17］。白細胞介素6能夠促進細胞增殖、分化，在炎性急性反應時相起著十分重要的作用。白細胞介素6的分泌能力隨著MSCs供體年齡的增加而增加［19］。

2.8 調節細胞生物學行為相關基因在衰老MSCs的表達 研究表明［20］，端粒依賴機制的細胞衰老，往往是由細胞周期相關蛋白p53和它的下游p21cip1所觸發。p16INK4A對細胞的衰老也具有十分重要的作用。在不利于細胞生長的環境下，p16INK4A在細胞衰老過程中起到十分重要的作用。定量分析MSCs的細胞周期抑制蛋白發現，衰老的 MSCs往往伴隨著p16INK4A、p53、p21cip1的高表達［15］。Shibata 等［21］研究表明，衰老MSCs高表達p16INK4A，但不高表達p53和p21cip1，這也提示p16INK4A在MSCs衰老過程中起主導作用。衰老MSCs高表達p16INK4A，且與SA-β-Gal活性呈正相關，與Kit67呈負相關。運用小干擾RAN轉染衰老MSCs的p16INK4A表達，能促進細胞增殖，逆轉MSCs衰老。轉染人端粒酶反轉錄酶后，MSCs不表達p16INK4A，細胞出現永生化，這也提示p16INK4A在細胞衰老中起十分重要的作用。

近年來，細胞外基質信號調節激酶、細胞外調節蛋白激酶1/2通道引起研究者的重視。當MSCs、MSCs增殖負性調節因子和肝細胞生長因子共培養時，細胞外調節蛋白激酶1/2活性明顯增強。p38絲裂原活化蛋白激酶通道參與該過程［22］。研究表明［23］，細胞外調節蛋白激酶1/2信號通道在體外也參與了MSCs的增殖。當細胞與細胞外調節蛋白激酶1/2通道抑制劑PD98059共培養時，能抑制MSCs的增殖作用。

TGF-β的β1、β2兩個亞單位具有抑制細胞增殖的作用［24］。研究表明［25］，衰老 MSCs 的 TGF-β1、TGF-β2及 TGF-β 受體 1 mRNA 高表達。但 TGF-β3及其他受體的表達未變。Smad蛋白信號通道參與了該過程。外源性 TGF-β1、TGF-β2與 MSCs共培養時能促進p16INK4A和p53-p21cip1通道的活化。

2.9 影響MSCs增殖的因素 MSCs增殖能力受供體的年齡、培養的密度、培養基成分、細胞因子的水平等多種因素的影響［5］?；铙w組織衰老與體外復制性衰老一致性存在很多爭議。但目前較為一致的觀點是體細胞的增殖能力與供體的年齡存在負相關。Shitata等［21］研究表明，來源于年老供體的 MSCs培養代數大約是年輕供體的1/4。MSCs形成細胞集落數隨著供體年齡的增加而下降。成體組織來源的MSCs的擴張能力較胚胎組織明顯減弱［26］。來源于老年個體的 MSCs表現為衰老征象［7］，SA-β-Gal陽性數目顯著增加，這提示供體的衰老能導致MSCs的衰老［27］。但也有一些研究表明［28］，供體年齡、增殖速率、細胞復制壽命與SA-β-Gal活性之間并不存在相關性。

3 MSCs衰老與SLE的關系

SLE是一種自身免疫異常、多器官受累的全身性疾病。研究表明［29］，SLE是一種MSCs異常性疾病。SLE患者MSCs存在異常，異基因來源的MSCs移植可有效治療SLE患者及動物模型。Papadaki等［30］研究表明SLE患者骨髓MSCs不能正常支持造血。SLE患者的骨髓MSCs體外培養傳代明顯低于正常人，細胞因子白細胞介素7等表達異常，向成骨細胞及脂肪細胞分化能力減弱［31］。SLE患者MSCs超微結構可見大量自噬體和細胞骨架異常［32］。最近Nie等［33］報道SLE患者骨髓MSCs生長緩慢，這提示SLE患者骨髓MSCs可能是一種衰老的MSCs。最近研究結果初步表明，正常骨髓MSCs與SLE患者骨髓MSCs細胞周期相關蛋白表達存在差異，p16INK4A在SLE患者骨髓MSCs表達明顯增高，其相互作用的細胞周期素依賴性蛋白激酶4/6表達顯著下降、p-Rb表達降低，骨髓MSCs呈現顯著的周期抑制，細胞停滯在G0/G1期。然而通過siRNA干擾SLE患者骨髓MSCs p16INK4A的表達后，可以逆轉 SLE患者骨髓MSCs的衰老特征。這提示細胞周期相關蛋白可能參與了SLE患者骨髓 MSCs的衰老過程，并影響MSCs的功能。

4 結語

MSCs由于具有多向分化、免疫抑制、誘導免疫耐受及在體外能大量擴增的能力，所以越來越受到學者們的重視，在細胞治療領域具有廣闊的應用前景。目前研究表明MSCs在自身免疫性疾病，尤其是SLE的發生、發展中具有十分重要的作用。遺傳因素及體內環境因素導致MSCs的衰老進而影響MSCs的功能和作用。因此對SLE患者MSCs的衰老研究具有十分重要的意義。

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