Collectrin的研究現狀

曹譯心，張 旭(綜述)，馬躍榮(審校)

(瀘州醫學院1組織學與胚胎學教研室，2病理學教研室，四川瀘州646000)

Collectrin基因分離克隆于1999年。Collectrin基因與血管緊張素轉換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)具有高度同源性。目前研究發現Collectrin受肝細胞核因子(hepatocyte nuclear factor-1，HNF-1)調控，能與可溶性 NSF附著蛋白受體(soluble NSF attachment protein receptor，SNARE)復合體相互作用，在腎臟氨基酸及Na+轉運以及胰島素的分泌等方面具有重要作用。在此就Collectrin結構及功能的研究現狀予以綜述。

1 Collectrin結構及表達

Collectrin基因(原名NX-17，又名Tmem27)是于1999年在小鼠5/6腎切除后，腎小球的高濾過、高增生期的殘余腎臟組織中分離克隆的一個新的基因(GenBank 登錄號:AF178085)［1］。基因表達性研究已證實，該基因產物主要是特異性地表達于人、大鼠和小鼠腎臟近端小管和集合管［2］以及胰島 β細胞［3］。人和小鼠的Collectrin序列在核苷酸和氨基酸水平分別有86.9%和87.4%的同源性。人和小鼠Collectrin蛋白的一級結構相似，氨基端位于細胞外，具有14個氨基酸組成的信號肽，羧基端位于細胞內，跨膜區由23個氨基酸組成。細胞外結構域包含127個氨基酸，并具有3個糖基化位點，提示Collectrin為Ia型跨膜糖蛋白［4］。人Collectrin與人血管緊張素轉換酶的同源基因(ACEH)及人ACE2具有高度同源性。Collectrin與ACE2的C端序列(包括部分細胞外區、跨膜區及細胞內區)具有47.8%的同源性［4，5］。Collectrin基因位于 X 染色體短臂2區2帶(Xp22)，與ACE2來源于同一個BAC克隆并分布于同一條染色體上，外顯子/內含子染色體定位及結構域分布提示Collectrin與ACE2及ACE來源于相同的祖先基因［6-8］。

在腎的發育過程中，在妊娠第13天可以測到mRNA信號，并且蛋白產物表達于輸尿管芽的分支。其后一直到新生兒期，其表達不斷增加，之后又逐漸減少［8］。通過分析Collectrin在非洲蟾蜍胚胎各個時期前腎的表達發現，Collectrin在整個前腎系統(包括近段、遠段和中腎管)都高表達［9］。

2 Collectrin的功能

2.1 Collectrin在腎臟氨基酸轉運中的作用Malakauskas等［10］建立了 Collectrin基因剔除小鼠。發現Collectrin基因剔除小鼠出現明顯的氨基酸尿癥而使尿液濃縮能力下降。如果氨基酸尿癥狀明顯，將導致幾乎所有的氨基酸都丟失，以致形成顯著的結晶尿癥。Danilczyk等［11］研究發現，Collectrin連同多種頂膜運載體形成一組腎臟的氨基酸轉運體。在爪蟾卵和犬腎傳代細胞中，Collectrin的表達通過B0AT1運載體加強了氨基酸轉運。Collectrin靶向斷裂小鼠因為頂膜的氨基酰轉運蛋白的下調而導致嚴重的腎氨基酸攝取障礙。Vanslambrouck等［12］研究發現，在發育性亞氨基甘氨酸尿癥(即新生兒期生理性的亞氨基甘氨酸尿)中之所以會出現亞氨基甘氨酸尿，是因為在新生兒期集合管上皮細胞頂端缺乏Slc6a18、Slc6a19、Slc6a20a和輔助蛋白 Collectrin 的表達。亞氨基甘氨酸尿隨著它們表達的增加而使逐漸消退。Singer等［13］研究發現孤立轉運蛋白Slc6a18(XT2)具有Na+及Cl－依賴的中性氨基端轉運功能。而在腎臟中 XT2要發揮功能就必須在Collectrin的協助下才得以實現。上述研究均提示Collectrin和腎臟氨基酸的轉運有關，并且扮演十分重要的角色，如果Collectrin表達異常將導致嚴重的腎臟氨基酸重吸收障礙。

2.2 Collectrin 對胰島細胞的調控 Fukui等［3］和Yamagata等［14］研究發現，在大鼠胰島瘤細胞系INS-1中或在轉基因小鼠的胰島β細胞中Collectrin的過表達增強了葡萄糖刺激的胰島素分泌，但并不影響Ca2+入胞作用。相反地抑制Collectrin減弱了胰島素的分泌，說明Collectrin在體內可以增強葡萄糖刺激的胰島素分泌。他們的研究還發現Collectrin通過與snapin(一種 SNAP-25結合蛋白)的相互作用和SNARE復合體結合，并且促進SNARE復合體形成。因此，Collectrin是SNARE復合體功能調節器，并借此調控胰島素的外泌。Collectrin不僅可以增強胰島素的分泌，而且還可以刺激胰島 β細胞增殖。Akpinar等［15］發現，Collectrin 在 Tcf1－/－小鼠胰島 β細胞中的表達下降，但是在胰腺內分泌部肥大模型(胰島肥大模型)小鼠的胰島β細胞中其表達升高。Collectrin形成二聚體，其細胞外區被糖基化、分離，并且從β細胞膜上脫落。這種分離過程只在β細胞才有，而不見于其他類型的細胞。全長Collectrin的過表達(而非截短了的Collectrin或可溶性蛋白)可增加其與胸腺嘧啶脫氧核苷的結合。相反，利用RNA干擾技術沉默Collectrin基因導致細胞復制減少。Collectrin表達增加的轉基因小鼠其胰島β細胞群也增加。這些都提示，Collectrin能刺激胰島細胞的增殖。綜上，Collectrin在胰島素的分泌過程中直接或間接發揮了重要作用。

2.3 Collectrin可能在鹽敏感性高血壓中的鈉潴留中起主導作用 Yasuhara等［16］發現沉默 Collectrin表達將導致膜相關水通道2、α-上皮鈉通道以及H+-三磷酸腺苷酶的減少，Collectrin和SNARE復合體在大鼠的集合管內大量表達。給予自發性高血壓大鼠和對照組大鼠正常鹽量飲食以及高鹽飲食10周，高鹽飲食組血壓顯著增高，雖然兩組均出現醛固酮尿排泄的顯著抑制，但Collectrin表達上調且和膜內水通道2、α-上皮鈉通道以及H+-三磷酸腺苷酶的維持有關;Collectrin啟動子活性、mRNA以及蛋白表達均上調，泛素化的Collectrin在高NaCl作用下減少，并且該結果不能夠被mIMCD-3細胞內的醛固酮所改變。通過這項研究他們認為，由非醛固酮依賴性高NaCl導致的Collectrin上調在功能上通過SNARE復合體與頂膜蛋白質物質轉運相關聯，并且Collectrin可能在鹽敏感性高血壓中的鈉潴留中起主導作用。

2.4 Collectrin在正常腎臟結構形成和維持中的作用 Collectrin位于靠近腎外周區的小囊泡并且結合于 γ-肌動蛋白-肌球蛋白Ⅱ-A、SNARE復合體和polycystin-2-polaris復合體，這些都和細胞內小囊泡及膜蛋白的纖毛運動有關。在mIMCD3細胞系中沉默Collectrin可以引起其纖毛形成缺陷，導致細胞增殖增加和凋亡，以及初級纖毛中的polycystin-2消失。抑制后腎培養細胞的Collectrin mRNA將導致在輸尿管芽分支中形成多發縱向的小囊。這些試驗結果提示，Collectrin是初級纖毛特異性膜蛋白recycling所必需的，它可以維持集合管初級纖毛的形成并保持極性［17］。張宏等［18］構建了 Collectrin 的正、反義真核表達載體，然后他們將Collectrin的不同融合載體轉染體外培養的集合管細胞，在不同時間點觀察不同融合基因的作用效果。結果表明，當Collectrin表達被阻抑的情況下，細胞難以維持正常的生長而大量死亡;但是，Collectrin的過表達并未引起細胞的大量增殖。提示Collectrin可能為維持細胞正常生長、存活的基本元件，而并不在細胞增殖過程中發揮關鍵作用。

2.5 其他 張宏等［19］以 Collectrin為“誘餌”蛋白，應用改進的酵母雙雜交系統-酵母接合的方法，對正常人腎臟cDNA文庫進行了篩選。獲得了與Collectrin存在直接相互作用的5種蛋白:氨基酸轉運蛋白XAT2、精氨琥珀酸合成酶、鞘磷脂激活蛋白、金屬硫蛋白2A和NADH脫氫酶1。通過分析這些已知蛋白的功能信息，可以為尋找Collectrin的功能提供線索。Malakauskas等［20］報道，他們測量了Collectrin基因剔除小鼠［Collectrin(-/y)小鼠］胰腺的形態、葡萄糖穩態狀況，胰腺功能和離體胰島的葡萄糖刺激胰島素分泌試驗，發現Collectrin基因缺乏的小鼠通過多種機制來保護能量的體內穩態以避免營養物質流失。

3 Collectrin的調控

現有的研究表明，在體外Collectrin基因啟動子能被 HNF-1α 和 HNF-1β 激活［3，14］，阻斷 HNF-1 結合位點將使Collectrin的啟動子活性降低80%;在體內Collectrin的表達受HNF-1α的調節，而不受HNF-1β的調節［14］。Yamagata 等［14］為了研究 Collectrin 和HNF-1α和 HNF-1β的生理功能，評估了 HNF-1α、HNF-1β和Collectrin在成年小鼠胰腺的表達模式。免疫組化研究發現，Collectrin表達在HNF-1α陽性的胰島細胞，而不表達于外分泌細胞。Collectrin同時也表達在HNF-1α陽性的形成中的小鼠胰腺。HNF-1β只表達于外分泌導管細胞，而不表達于內分泌細胞。HNF-1β和Collectrin雙染顯示，Collectrin不表達于HNF-1β陽性細胞。這表明在體內Collectrin的表達受HNF-1α的調節，而不受HNF-1β的調節。同樣，在腎臟，免疫組化也顯示Collectrin表達在HNF-1α陽性的細胞。這些都提示 HNF-1α可能是重要的Collectrin轉錄調節因子。此外，他們的研究還發現胰十二指腸同源盒基因1對Collectrin的轉錄也有調節作用，但是較HNF-1α弱。此外，Saisho等［21］研究發現葡萄糖可以上調 Collectrin蛋白在MIN6β細胞株的表達，而這一過程是通過線粒體的枸櫞酸循環中間體來介導的。由此可見，HNF-1是Collectrin最主要的調控因素，而調控是發生在轉錄水平上的。

4 結語

作為一個新近發現的在腎集合管上皮及胰島β細胞特異表達的蛋白，Collectrin有多種功能，其功能障礙參與了多種疾病的發生。在目前的研究成果里，最引人矚目的莫過于Collectrin參與腎臟氨基酸轉運及胰島素的分泌，但是其相關機制尚待進一步的深入研究，相信當相關機制研究清楚以后，必將為相應的臨床疾病的診治提供新思路、新方法。

［1］Zhang H，Wada J，Kanwar YS，et al.Screening for genes upregulated in 5/6 nephrectomized mouse kidney［J］.Kidney Int，1999，56(2):549-558.

［2］Li H，Zang H，Wang HY，et al.Collectrin，a kidney-specific gene，is localized in collecting duct cells in kidney［J］.China J Mod Med，2004，14(10):12-15.

［3］Fukui K，Yang Q，Cao Y，et al.The HNF-1 target Collectrin controls insulin exocytosis by SNARE complex formation［J］.Cell Metab，2005，2(6):373-384.

［4］張宏，和田淳，李寒，等.人Collectrin同源基因的分離克隆及其在人腎集合管和遠曲小管的特異表達［J］.中國生物化學與分子生物學報，2004，20(5):630-636.

［5］Turner AJ，Tipnis SR，Guy JL，et al.ACEH/ACE2 is a novel mammalian metallocarboxypeptidase and a homologue of angiotensinconverting enzyme insensitive to ACE inhibitors［J］.Can J Physiol Pharmacol，2002，80(4):346-353.

［6］Donoghue M，Hsieh F，Baronas E，et al.A novel angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase(ACE2)converts angiotensin I to angiotensin 1-9［J］.Circ Res，2000，87(5):E1-9

［7］Tipnis SR，Hooper NM，Hyde R，et al.A human homolog of angiotensin-coveting enzyme.Cloning and functional expression as a captopril-insensitive carboxypeptidase［J］.J Biol Chem，2000，275:33238-33243.

［8］Zhang H，Wada J，Hida K，et al.Collectrin，a collecting duct-specific transmembrane glycoprotein，is a novel homolog of ACE2 and is developmentally regulated in embryonic kidneys［J］.J Biol Chem，2001，276(20):17132-17139.

［9］McCoy KE，Zhou X，Vize PD.Collectrin/tmem27 is expressed at high levels in all segments of the developing Xenopus pronephric nephron and in the Wolffian duct［J］.Gene Expr Patterns，2008，8(4):271-274.

［10］Malakauskas SM，Quan H，Fields TA，et al.Aminoaciduria and altered renal expression of luminal amino acid transporters in mice lacking novel gene Collectrin［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2007，292(2):F531.

［11］Danilczyk U，Sarao R，Remy C，et al.Essential role for Collectrin in renal amino acid transport［J］.Nature，2006，444(7122):1088-1091.

［12］Vanslambrouck M，Broer A，Thavyogarajah T，et al.Renal imino acid and glycine transport system ontogeny and involvement in developmental iminoglycinuria［J］.Biochem J，2010，428(3):397-407.

［13］Singer D，Camargo SM，Huggel K，et al.Orphan transporter SLC6A18 is renal neutral amino acid transporter B0AT3［J］.J Biol Chem，2009，284(30):19953-19960.

［14］Yamagata K，Nammo T，Sato Y，et al.The HNF-1a-SNARE connection［J］.Diabetes Obes Metab，2007，9(2):40-45.

［15］Akpinar P，Kuwajima S，Krützfeldt J，et al.Tmem27:a cleaved and shed plasma membrane protein that stimulates pancreatic beta cell proliferation［J］.Cell Metab，2005，2(6):385-397.

［16］Yasuhara A，Wada J，Malakauskas SM，et al.Collectrin is involved in the development of salt-sensitive hypertension by facilitating the membrane trafficking of apical membrane proteins via interaction with soluble N-ethylmaleiamide-sensitive factor attachment protein receptor complex［J］.Circulation，2008，118(21):2146-2155.

［17］Zhang Y，Wada J，Yasuhara A，et al.The role for HNF-1β-targeted Collectrin in maintenance of primary cilia and cell polarity in collecting duct cells［J］.PLoS ONE，2007，2(5):e414.

［18］張宏，王湘玲，張艷玲，等.小鼠Collectrin正反義真核表達載體的構建及其功能［J］.北京大學學報(醫學版)，2004，36(2):181-184.

［19］張宏，張艷玲，梁秀彬，等.應用酵母雙雜交系統篩選新基因Collectrin相關蛋白［J］.中國生物化學與分子生物學報，2005，21(2):180-184.

［20］Malakauskas SM，Kourany WM，Zhang XY，et al.Increased insulin sensitivity in mice lacking Collectrin，a downstream target of HNF-1alpha［J］.Mol Endocrinol，2009，23(6):881-892.

［21］Saisho K，Fukuhara A，Yasuda T，et al.Glucose enhances Collectrin protein expression in insulin-producing MIN6 beta cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，389(1):133-137.