MicroRNA在骨代謝中的研究進(jìn)展

謝福平(綜述)，陳 江(審校)

(1.福建醫(yī)科大學(xué)研究生院，福州350004;2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科，福州350002)

骨是由骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、礦物質(zhì)等構(gòu)成。正常生理狀態(tài)下，骨是通過以上各種細(xì)胞新陳代謝維持在一個相對動態(tài)平衡狀態(tài)下，假若平衡狀態(tài)被打破，隨之而來的是骨病理狀態(tài)，如骨質(zhì)疏松、石骨癥。因此，研究基礎(chǔ)病變對于疾病的了解及治療具有相當(dāng)重要的意義。

近年來，microRNA(miRNA)逐漸被人們熟知，miRNA在細(xì)胞分化，生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮巨大作用，越來越多的引起研究人員的關(guān)注［1］。現(xiàn)針對miRNA在骨代謝相關(guān)研究及其進(jìn)展予以綜述。

1 miRNA概述

miRNA最先由Lee等［2］發(fā)現(xiàn)，是一種含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的，非蛋白編碼的小RNA分子(21～23個核苷酸)，類似于小干擾RNA。miRNA基因類似于許多編碼蛋白基因，通常是在細(xì)胞核內(nèi)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，最初產(chǎn)物為大的具有5'帽子結(jié)構(gòu)和3'多聚腺苷酸尾的微小RNA前體(pri-miRNA)。Pri-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下，5'帽子結(jié)構(gòu)和3'多聚腺苷酸尾被剪切，變?yōu)榧s70個核苷酸組成的 pre-miRNA。RAN-GTP和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(exportin)將pre-miRNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中［3］。隨后，另一個核酸酶Dicer將其莖環(huán)結(jié)構(gòu)剪切，產(chǎn)生約為22個核苷酸長度的miRNA:miRNA*雙鏈。Dicer將成熟的RNA雙鏈釋放后，很快被一組蛋白反應(yīng)結(jié)合形成RNA-蛋白復(fù)合物，被稱為miRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物。在miRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物中，一條成熟的單鏈miRNA保留在這一復(fù)合體中，它能識別位于靶mRNA上3'端非編碼區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)。加工成熟后miRNA通過和靶基因mRNA堿基配對引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或阻礙其翻譯，具有破壞目標(biāo)特異性基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者誘導(dǎo)翻譯抑制的功能。

miRNA以及RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物在動物［4］和植物［5］中廣泛表達(dá)。miRNAs只在特定的組織和發(fā)育階段表達(dá)，具有組織特異性和時序性，決定著組織和細(xì)胞的功能特異的調(diào)節(jié)過程中起重要作用［6］。

2 miRNA與骨形成相關(guān)細(xì)胞

干細(xì)胞是存在于生物體內(nèi)具有強(qiáng)大的分化增殖潛能的細(xì)胞，對于機(jī)體生長發(fā)育、損傷后修復(fù)、新陳代謝等均具有重大的意義。成人的基質(zhì)干細(xì)胞是一類未分化的多潛能細(xì)胞，主要位于骨髓中，能分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等等。miRNA是細(xì)胞增殖分化中的重要調(diào)節(jié)分子，與干細(xì)胞的增殖分化具有極為密切的關(guān)系，不論是在動物胚胎期骨的形成階段，還是在骨骼生長發(fā)育期抑或是成熟期，均有著重要的影響。

2.1 miRNA與胚胎期骨的發(fā)生發(fā)育 為了解miRNA在動物胚胎發(fā)育期的作用，研究者構(gòu)建了Dicer基因剔除的小鼠，因為所有miRNA的成熟需要Dicer的參與，所以所有miRNA形成缺陷，這些基因缺陷鼠出生時就有明顯的生長缺陷，沒有母乳喂養(yǎng)時即死去。其骨骼大小明顯比正常鼠小，尤其是軟骨的分化增殖所受影響最大，因此，miRNA在骨形成階段以及動物的生長發(fā)育都是必不可少的［7］。如果說Dicer基因缺失使得全體miRNA功能異常，引起動物生長發(fā)育異常是毫無疑問的，那么個別miRNA功能缺失會如何呢?Watanabe等［8］剔除 Dnm3os基因(轉(zhuǎn)錄 miR-199a、miR-199a* 、miR-214)，觀察到Dnm3os基因缺失的幼犬絕大多數(shù)死于出生后1個月內(nèi)。而Dnm3os基因缺失小鼠顯示出許多骨骼異常癥狀，包括顱頜面發(fā)育不全、脊椎發(fā)育缺陷癥、骨質(zhì)減少等。更為重要的是，miR-199a、miR-199a*、miR-214在胚胎期表達(dá)水平明顯下調(diào)。這表明，Dnm3os基因在哺乳動物骨骼正常生長過程中具有不可或缺的地位。同時也說明miRNA與胚胎期干細(xì)胞的分化及增殖關(guān)系密切。

在動物胚胎發(fā)育完成后，miRNA在干細(xì)胞行使分化功能時，依然起著至關(guān)重要的作用。Oskowitz等［9］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA調(diào)節(jié)人骨髓多潛能干細(xì)胞分化及白血病抑制因子的表達(dá);當(dāng)向成骨細(xì)胞分化時，19種miRNA表達(dá)水平上調(diào);向脂肪細(xì)胞分化時，20種miRNA表達(dá)水平上調(diào);hsa-mir199a和hsa-mir346抑制白血病抑制因子的分泌。Bae等［10］比較干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞miRNA表水平的差異，發(fā)現(xiàn)有20多種miRNA表達(dá)水平具有明顯差別。顯然，miRNA介導(dǎo)的干細(xì)胞分化是維持細(xì)胞的更新所必需的。

人的一生中，細(xì)胞總是在不斷分化、增殖、凋亡，周而復(fù)始的運(yùn)作以達(dá)到維持細(xì)胞的動態(tài)平衡，骨組織當(dāng)然也不能例外。近年來，由于miRNA研究的風(fēng)靡，許多學(xué)者將干細(xì)胞的分化與miRNA之間的關(guān)系作為研究重點(diǎn)。

2.2 miRNA調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞 干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化通常是在runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)調(diào)節(jié)下轉(zhuǎn)變?yōu)榍俺晒羌?xì)胞，前成骨細(xì)胞又接著在RUNX2、OSX作用下分化為成骨細(xì)胞，而RUNX2又受Smad家族蛋白、DLX3/5調(diào)控［11］;同時，骨形成蛋白也能影響Smad家族蛋白表達(dá)而影響干細(xì)胞的分化。骨形成蛋白與受體結(jié)合，激活Smad家族蛋白，Wnt激活。活化的Wnt依次激活卷曲蛋白、脂蛋白受體相關(guān)蛋白、DSH、軸素，形成復(fù)合物。該復(fù)合物使Axin-glycogen synthase-3β-APC復(fù)合物不穩(wěn)定，從而抑制β連環(huán)蛋白水解，β連環(huán)蛋白濃度升高，移入細(xì)胞核與T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞因子增強(qiáng)因子結(jié)合，從而促進(jìn)特定基因表達(dá)，干細(xì)胞、前成骨細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞生成增多，并抵抗成骨細(xì)胞的凋亡［12］。

有研究［13］發(fā)現(xiàn)miR-29b能直接下調(diào)組蛋白脫乙酰化酶、轉(zhuǎn)化生長因子β3、ⅡA型活化素A受體等蛋白生成量，這些蛋白作為成骨細(xì)胞分化抑制物，表達(dá)水平降低有利于促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。同時，miR-29b減少 COL1A1、COL5A3、COL4A2 3'端非編碼區(qū)序列活性，從而減少或抑制膠原的合成。當(dāng)膠原蛋白分泌達(dá)到一個穩(wěn)定期時，miR-29b濃度升高，抑制膠原蛋白的合成，促進(jìn)骨質(zhì)礦化，利于骨質(zhì)生成。

miR-206在骨形成蛋白2干預(yù)成纖維細(xì)胞系(C2C12)細(xì)胞后，表達(dá)水平下降。同樣，在C2C12細(xì)胞中激活Smad1/4后亦表現(xiàn)為miR-206表達(dá)減少，而Pri-miR-206表達(dá)水平升高，這表明骨形成蛋白2是通過抑制Pri-miR-206轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒靘iR-206這一環(huán)節(jié)而實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞分化調(diào)節(jié)功能［14］。

在細(xì)胞和動物實(shí)驗中，發(fā)現(xiàn)在骨形成蛋白2誘導(dǎo)的骨形成過程中，miR-2861［15］過表達(dá)增強(qiáng)骨形成蛋白2誘導(dǎo)的骨形成作用，反之，減少miR-2861的表達(dá)，骨形成蛋白2誘導(dǎo)骨形成作用被減弱。在小鼠體內(nèi)沉默 miR-2861編碼基因，可以觀察到減少RUNX2表達(dá)，進(jìn)而抑制骨形成，減少骨量，臨床實(shí)驗亦觀察到miR-2861缺失患者，出現(xiàn)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。

Schoolmeesters等［16］在研究人干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化時發(fā)現(xiàn)，miRNA-489、miRNA-27a表達(dá)水平下調(diào)，miRNA-148b表達(dá)水平上調(diào)。其中，miRNA-489、miRNA-27a靶向大量基因編碼的RNA，但是AHSG、PEX7RD為二者共同的靶點(diǎn)。AHSG和CHRD基因編碼骨形成蛋白信號蛋白抑制物;PEX7編碼過氧化物體病毒基質(zhì)酶受體(骨形成過程中的關(guān)鍵酶)。

miR-141和miR-200a作為前成骨細(xì)胞分化相關(guān)miRNA，能明顯調(diào)節(jié)骨形成蛋白2誘導(dǎo)的前成骨細(xì)胞的分化，這種調(diào)節(jié)機(jī)制是通過抑制DLX5轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)的［17］。

綜上所述，凡是對干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的信號通路中的信號蛋白具有調(diào)節(jié)作用的miRNA，對干細(xì)胞的分化均有調(diào)節(jié)作用。據(jù)文獻(xiàn)報道，has-miR-135b［18］、miR-204［19］、miR-26a［20］等許多 miRNA 都是通過信號通路中的信號蛋白調(diào)節(jié)，達(dá)到對干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)作用，因此在此不做贅述。

2.3 miRNA 調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝 miR-199a*［21］明顯抑制早期軟骨形成，減少早期標(biāo)志基因如軟骨寡聚基質(zhì)蛋白、Ⅱ型膠原等表達(dá)，同時，miR-199 a*又能抑制Smad1/4介導(dǎo)的靶基因反式激活作用，這兩種抑制作用都同時指向軟骨生成被抑制。盡管如此，在試驗中又觀察到，miR-199a*隨著骨形成蛋白2誘導(dǎo)軟骨形成的過程，其表達(dá)水平逐漸上升，推測miR-199a*可能是軟骨形成和成熟階段所必需的調(diào)節(jié)器。

骨關(guān)節(jié)炎是一類嚴(yán)重關(guān)節(jié)性疾病，miRNA-140與骨關(guān)節(jié)炎有密切關(guān)系。Miyaki等［22］通過細(xì)胞實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞miRNA-140表達(dá)水平明顯低于正常人軟骨細(xì)胞miRNA-140表達(dá)水平，并且白細(xì)胞介素1β能抑制miRNA-140的表達(dá)。這都說明在炎癥狀態(tài)下，miRNA-140表達(dá)水平受到影響，從而引發(fā)骨關(guān)節(jié)病。值得一提的是，Jones等［23］研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎患者與正常人軟骨細(xì)胞中多種miRNA表達(dá)水平具有明顯差異。比較突出的是miR-9、miR-98、miR146。miR-9 和 miR-98 過表達(dá)或者miR-146表達(dá)減少，減少了白細(xì)胞介素1β誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子α產(chǎn)出量。上述研究結(jié)果有所不同，但是它們共同表明miRNA的變化導(dǎo)致了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。因此，miRNA與骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系密切。

2.4 miRNA與破骨細(xì)胞 破骨細(xì)胞前體分化過程中，DGCR8、Dicer1、Ago2基因在miRNA生物合成起重要作用，沉默 DGCR8、Dicer、Ago2基因后，全面抑制破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，減少破骨細(xì)胞形成，減少骨吸收。miR-223、NFI-A、巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體與破骨細(xì)胞形成和分化有關(guān)，其中，巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體是破骨細(xì)胞分化功能中的重要因子。因此，miR-223通過調(diào)節(jié)NFI-A和巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體水平，而達(dá)到對破骨細(xì)胞的分化進(jìn)行調(diào)節(jié)［24］。

3 小結(jié)

miRNA是生物生命過程中的重要調(diào)節(jié)分子，所以研究miRNA與骨疾病特別是miRNA與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系，對口腔種植的發(fā)展具有重要的意義。隨著對miRNA作用機(jī)制的深入研究，人們對高等真核生物基因表達(dá)調(diào)控的了解將會達(dá)到更高的水平。這也將使miRNA可能成為疾病診斷的新的生物學(xué)標(biāo)記，還可能使得這一分子成為藥靶，或是模擬這一分子進(jìn)行新藥研發(fā)，這將可能會給人類疾病的治療提供一種新的手段。

［1］趙爽，劉默芳.MicroRNA作用機(jī)制研究的新進(jìn)展［J］.中國科學(xué) C 輯:生命科學(xué)，2009，39(1):109-113.

［2］Lee RC，F(xiàn)einbaum RL，Ambros V.The C.Elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs withantisense complementarity to lin-14［J］.Cell，1993，75(5):843-854.

［3］Yi R，Qin Y，Macara IG，et al.Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs［J］.Genes Dev，2003，17(24):3011-3016.

［4］Zhang L，Chia JM，Kumari S，et al.A genome-wide characterization of microRNA genes in maize［J］.PLoS Genet，2009，5(11):e1000716.

［5］Lim LP，Glasner ME，Yekta S，et al.Vertebrate microRNA genes［J］.Science，2003，299(5612):1540.

［6］John B，Enright AJ，Aravin A，et al.Human microRNA targets［J］.PLoS Biol，2004，2(11):e363.

［7］Kobayashi T，Lu J，Cobb BS，et al.Dicer-dependent pathways regulate chondrocyte proliferation and differentiation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(6):1949-1954.

［8］Watanabe T，Sato T，Amano T，et al.Dnm3os，a non-coding RNA，is required for normal growth and skeletal development in mice［J］.Dev Dyn，2008，237(12):3738-3748.

［9］Oskowitz AZ，Lu J，Penfornis P，et al.Human multipotent stromal cells from bone marrow and microRNA:regulation of differentiation and leukemia inhibitory factor expression［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(47):18372-18377.

［10］Bae S，Ahn JH，Park CW，et al.Gene and microRNA expression signatures of human mesenchymal stromal cells in comparison to fibroblasts［J］.Cell Tissue Res，2009，335(3):565-573.

［11］Mizuno Y，Tokuzawa Y，Ninomiya Y，et al.miR-210 promotes osteoblastic differentiation through inhibition of AcvR1b［J］.FEBS Lett，2009，583(13):2263-2268.

［12］Sun S.Bone disease drug discovery:examining the interactions between osteoblast and osteoclast［J］.Expert Opin Ther Targets，2008，12(2):239-251.

［13］Li Z，Hassan MQ，Jafferji M，et al.Biological functions of miR-29b contribute to positive regulation of osteoblast differentiation［J］.J Biol Chem，2009，284(23):15676-15684.

［14］Sato MM，Nashimoto M，Katagiri T，et al.Bone morphogenetic protein-2 down-regulates miR-206 expression by blocking its maturation process［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，383(1):125-129.

［15］Li H，Xie H，Liu W，et al.A novel microRNA targeting HDAC5 regulates osteoblast differentiation in mice and contributes to primary osteoporosis in humans［J］.J Clin Invest，2009，119(12):3666-3677.

［16］Schoolmeesters A，Eklund T，Leake D，et al.Functional profiling reveals critical role for zmiRNA in differentiation of human mesenchymal stem cells［J］.PLoS One，2009，4(5):e5605.

［17］Itoh T，Nozawa Y，Akao Y.MicroRNA-141 and-200a are involved in bone morphogenetic protein-2-induced mouse pre-osteoblast differentiation by targeting distal-less homeobox 5［J］.J Biol Chem，2009，284(29):19272-19279.

［18］Schaap-Oziemlak A，Raymakers RA，Bergevoet SM，et al.MicroRNA hsa-miR-135b regulates mineralization in osteogenic differentiation of human Unrestricted Somatic Stem Cells(USSCs)［J］.Stem Cells Dev，2010，19(6):877-885.

［19］Huang J，Zhao L，Xing L，et al.MicroRNA-204 regulates Runx2 protein expression and mesenchymal progenitor cell differentiation［J］.Stem Cells，2010，28(2):357-364.

［20］Luzi E，Marini F，Sala SC，et al.Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stem cells is modulated by the miR-26a targeting of the SMAD1 transcription factor［J］.J Bone Miner Res，2008，23(2):287-295.

［21］Lin EA，Kong L，Bai XH，et al.miR-199a，a bone morphogenic protein 2-responsive MicroRNA，regulates chondrogenesis via direct targeting to Smad1［J］.J Biol Chem，2009，284(17):11326-11335.

［22］Miyaki S，Nakasa T，Otsuki S，et al.MicroRNA-140 is expressed in differentiated human articular chondrocytes and modulates interleukin-1 responses［J］.Arthritis Rheum，2009，60(9):2723-2730.

［23］Jones SW，Watkins G，Le Good N，et al.The identification of differentially expressed microRNA in osteoarthritic tissue that modulate the production of TNF-alpha and MMP13［J］.Osteoarthritis Cartilage，2009，17(4):464-472.

［24］Sugatani T，Hruska KA.Impaired micro-RNA pathways diminish osteoclast differentiation and function［J］.J Biol Chem，2009，284(7):4667-4678.