不同類型表面活性劑與高鐵肌紅蛋白相互作用

張瑩瑩 曹洪玉,2 唐 乾,2 鄭學仿,2,*

(1大連大學生命科學與技術學院,遼寧大連116622;2大連大學,遼寧省生物有機化學重點實驗室,遼寧大連116622)

不同類型表面活性劑與高鐵肌紅蛋白相互作用

張瑩瑩1曹洪玉1,2唐 乾1,2鄭學仿1,2,*

(1大連大學生命科學與技術學院,遼寧大連116622;2大連大學,遼寧省生物有機化學重點實驗室,遼寧大連116622)

通過UV-Vis吸收光譜、同步熒光光譜、圓二色(CD)光譜等方法對陰離子型表面活性劑——琥珀酸二辛酯磺酸鈉(AOT)和十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、陽離子型表面活性劑——十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)、兩性離子型表面活性劑——3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)與馬心高鐵肌紅蛋白(metMb)的不同作用機理進行了探討.結果顯示:陰、陽離子型表面活性劑可以與蛋白發生較強烈的作用,且相互作用與表面活性劑的濃度密切相關.AOT和SDBS濃度的升高使得metMb的Soret帶發生紅移且出現兩個新的Q帶,伴隨著配體金屬電荷轉移(LMCT)帶的消失,蛋白從水合的六配位高自旋復合物(6-cHs)轉化成六配位低自旋高鐵血紅素復合物(6-cLs),低濃度的AOT和SDBS對Tyr和Trp微環境均有影響,能使metMb的二級結構發生變化;而CTAB和DTAB在低濃度時對metMb的血紅素中心影響不大,但是對Trp和Tyr的微環境影響很大,高濃度時主要通過靜電吸引作用以聚合體形式直接作用于血紅素中心,使Soret帶發生藍移,metMb形成五配位高自旋(5-cHs)復合物,血紅素從疏水腔中釋放出來,metMb的α螺旋含量減少. DTAB由于自身結構的特點,與CTAB作用于蛋白的過程有些區別,形成了一個中間態,但最終也導致血紅素的暴露.兩性離子型表面活性劑在測定濃度范圍內不與metMb發生作用,原因是CHAPS整體呈電中性,其與metMb的陰離子性或者陽離子性位點作用的能力很弱,同時也說明metMb表面帶相反電荷的位點相距較遠.結果充分證明表面活性劑與蛋白相互作用的方式與表面活性劑的種類、結構及其濃度有關.

陰離子型表面活性劑;陽離子型表面活性劑;兩性表面活性劑;高鐵肌紅蛋白;光譜法

1 引言

表面活性劑與蛋白相互作用廣泛應用于食品、化妝品和藥物配方中.1,2人發和羊毛就是經常暴露于表面活性劑中的兩種蛋白質底物,表面活性劑能與蛋白分子相互作用并能透過細胞膜,沾在皮膚上的表面活性劑有0.5%滲入血液,皮膚上若有傷口則滲透力提高10倍以上,因此表面活性劑可以通過多種渠道進入人體內,在體內積少成多,與其他化學物質結合,毒性會增加數倍,有誘發癌特性.有些表面活性劑血溶性很強,容易引起血紅蛋白的變化,造成貧血癥.肌紅蛋白(Mb)在生物體內起著儲存氧和促進氧在細胞中擴散的作用,Mb與其他小分子物質如細菌內毒素、3海藻糖4和羥基脲5等相互作用結果表明,一些生物小分子可以使得氧合型肌紅蛋白(oxyMb)轉變成高鐵肌紅蛋白(metMb)和hemichrome的形式,而血紅素蛋白的hemichrome形式與一些異常疾病有關,6所以探討表面活性劑對人體蛋白的影響對生命過程中表面活性劑在生物體內毒性作用研究具有重要意義.

近年來,關于蛋白質與表面活性劑的作用研究多集中在二者作用時形成復合物的結合方式、表面特性及表面活性劑引起的蛋白質結構變化.7-9不同類型表面活性劑在不同條件下可形成具有不同結構的分子有序組合體,蛋白質是具有二級和三級結構的兩性聚電解質,隨著外界條件的變化,分子的荷電性質發生很大變化,因此二者相互作用機理較為復雜.Guo等10比較研究了十二烷基硫酸鈉(SDS)和CTAB與血紅蛋白(Hb)相互作用,得出了不同的pH條件下,SDS和CTAB對Hb的作用強度和作用力不同.在模擬人體弱堿性緩沖環境體系中全面比較和探討三種不同類型表面活性劑與metMb相互作用不同機理的研究尚無報道.為了能更詳細解釋表面活性劑與蛋白質相互作用的本質,本文選用UV-Vis吸收光譜、同步熒光光譜、CD光譜等技術分別研究了陰離子型表面活性劑AOT和SDBS、陽離子型表面活性劑CTAB和DTAB、兩性離子型表面活性劑CHAPS與metMb相互作用過程中不同機理及metMb二級結構變化,并從分子水平上分析了表面活性劑存在時metMb的構象變化及配位反應機理.

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

馬心肌紅蛋白樣品(美國Sigma公司),UV-Vis吸收光譜特征峰表明其幾乎全部為metMb,使用時用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(0.05 mol·L-1,pH= 7.4)(PB緩沖液)配制成濃度為8.0×10-6mol·L-1的溶液(避光4°C保存并盡快用于實驗);表面活性劑AOT(96%)、DTAB(～99%)、CHAPS(≥98%,TLC)均購自Sigma公司,SDBS(AR)購自天津市大茂化學試劑廠,CTAB(AR)購自天津市科密歐化學試劑開發中心,使用前用PB緩沖液配制成各自所需濃度,見實驗結果分析部分.實驗用水為超純水.儀器主要有日本Jasco公司的V-560型UV-Vis分光光度計、FP-6500型熒光分光光度計、J-810型圓二色分光光度計;德國Julabo公司的F-12型制冷和加熱循環器.

2.2 實驗方法

2.2.1 UV-Vis吸收光譜

在比色皿中加入8.0×10-6mol·L-1的metMb溶液2 mL,用微量注射器逐次加入定量的AOT溶液(累積總體積小于50 μL),混勻并避光作用3 min,以緩沖液加入等量的AOT溶液作參比,按照以下條件分別記錄AOT與metMb相互作用的紫外吸收光譜:狹縫寬度為2 nm,掃描波長范圍220-700 nm,掃描速率400 nm·min-1,響應時間中等.其他四種表面活性劑與metMb作用的紫外吸收光譜檢測方法同上.

2.2.2 同步熒光光譜

在比色池中加入8.0×10-6mol·L-1的metMb溶液2 mL,用微量注射器逐次加入定量的AOT溶液(累積總體積小于50 μL),混勻,避光作用,控制溫度為(25.00±0.01)°C,靜置3 min后,以Δλ=20 nm和Δλ=60 nm測定同步熒光光譜的變化情況.激發和發射狹縫分別為5 nm,掃描速率為500 nm·min-1,響應時間為0.5 s,檢測器靈敏度為中等(CTAB和DTAB為低).其他四種表面活性劑與metMb作用的熒光光譜檢測方法同上.

2.2.3 CD光譜

移取500 μL的8.0×10-6mol·L-1的metMb溶液于0.1 cm石英比色池中,用微量進樣器依次加入定量的AOT溶液(累積總體積小于10 μL),進行相互作用的圓二色譜測定.狹縫寬度為1 nm,掃描波長范圍為190-250 nm,掃描速度為50 nm·min-1,響應時間為2 s,累計次數為3次.CD光譜測定其他四種表面活性劑與metMb作用的方法同上.

3 結果與討論

3.1 陰離子型表面活性劑

metMb的UV-Vis吸收光譜受血紅素周圍的微環境影響.圖1A和1B分別為用0.034 mol·L-1的AOT、0.01 mol·L-1SDBS滴定濃度為8.0×10-6mol· L-1的metMb緩沖溶液體系測得的UV-Vis吸收光譜變化曲線.結果顯示AOT和SDBS對metMb具有相同的影響,下面以AOT為例說明實驗結論.可以看出,在天然狀態條件下,metMb溶液在409 nm(Soret帶),503 nm(Q帶)和630 nm(LMCT帶)處有特征吸收峰,這是血紅素的中心鐵原子與四個吡咯環的氮原子形成配位鍵,第五配位結合His-93殘基、第六配位結合一個水分子形成的6-cHs結構aquometMb的特征譜帶.11隨著AOT濃度的增加,到達2×10-4mol·L-1后,metMb的Soret帶吸光度值不斷減小;同時,吸收譜帶向長波長方向移動(409 nm紅移到約414 nm處),且536和566 nm處有新的吸收峰出現,并逐漸增強,630 nm處的LMCT帶消失.意味著表面活性劑濃度的增加,6-cHS結構的metMb在逐漸消耗.536和566 nm處的新峰與高鐵細胞色素b5的很相似,12是6-cLS結構的特征峰,此時蛋白質和表面活性劑之間的疏水作用和氫鍵破壞了水分子配體和His-64之間的氫鍵,His-64咪唑環上的氮原子氫鍵能力的減弱,已配位的水分子不再穩定,使得鐵原子第六配位水分子很容易解離出來,取而代之的是His-64.aquometMb逐漸減少,6-cLs結構的hemichrome在不斷生成,即His-64的咪唑環向金屬中心移動,形成了雙His配位復合物.13

圖1 AOT(A)及SDBS(B)對metMb溶液UV-Vis吸收光譜的影響Fig.1 Effects ofAOT(A)and SDBS(B)on UV-Vis absorbance spectra of metMb solutionCmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;(A)104CAOT/(mol·L-1):(a)0,(b)2.0,(c)2.4,(d)3.0,(e)3.4,(f)4.0; (B)104CSDBS/(mol·L-1):(a)0,(b)0.5,(c)0.7,(d)1.3,(e)1.5,(f)1.9

本課題組14研究發現,當咪唑與metMb分子進行配位反應時,由于這些親核性較強的咪唑分子的引入,咪唑分子電荷通過Fe3+轉移到卟啉環上,使得卟啉環上電子密度增大,a1u(π)軌道能量增加,與間的能量差減小,激發能降低,因此His-64咪唑環與血紅素中心鐵原子的配位可以造成Soret帶的紅移.另外,在譜圖中416 nm產生了一個等吸光點,說明此時體系中metMb和所形成的復合物具有相同的吸光度值.metMb的等電點(pI)是6.99,PB緩沖液的pH是7.4,所以metMb整體呈現負電性,其與陰離子表面活性劑之間存在靜電斥力,表面活性劑濃度升高時,疏水作用隨后形成.15AOT/SDBS存在時,占主導作用的靜電力使得血紅素周圍環境變化,破壞組氨酸咪唑環和水分子之間的氫鍵,從而誘導hemichrome的形成.

對于Mb的同步熒光光譜,Δλ=60 nm時主要是Trp殘基的特征發射峰,Δλ=20 nm時則主要顯示Tyr殘基的熒光.16圖2A是AOT與metMb作用時Δλ=60 nm的同步熒光光譜,可以看出,隨著AOT濃度的增加,339 nm處熒光峰和351 nm處的肩峰熒光強度均規律性地增加,且339 nm處的熒光峰紅移了3 nm.天然狀態下,metMb血紅素近端存在的Trp-7和Trp-14使得每個Trp的熒光部分猝滅,Trp到血紅素的有效能量轉移也被削弱,故metMb中的Trp在緩沖溶液中熒光強度很低.17AOT濃度逐漸升高時表面活性劑的疏水鏈滲入到疏水腔,Trp極性不斷增強,并逐漸從疏水環境中暴露出來,heme周圍環境的極性也有一定程度的增加,因此,Trp和血紅素之間的熒光猝滅反應被減弱,metMb中的Trp熒光強度逐漸增強.圖3A顯示的是SDBS對metMb的Trp熒光強度影響,與AOT影響作用相同.造成圖2A中351 nm處肩峰越來越明顯的原因是雙His配位體系的形成對metMb中Trp-7和Trp-14殘基微環境極性的影響不同.14圖2B和圖3B所示的是Tyr的熒光強度變化,在天然態時,metMb的Tyr與Trp和血紅素之間能量傳遞,有效地猝滅了Tyr自身的發射強度,而AOT/SDBS的加入使得Tyr的微環境發生變化,與Trp和heme的距離變遠,所以熒光強度不斷增強;18metMb發射峰越來越不明顯,我們認為是蛋白表面Tyr-103的Ph－OH基團在陰離子型表面活性劑存在時,變成Ph－O-形式,它在大約307 nm處的峰越來越尖,重疊峰使得311 nm處的最大發射峰趨于平緩.圖3B中約286 nm處的發射峰是SDBS濃度越來越高造成的(見圖3B插圖),其對311 nm處的發射峰也有一定的影響.

圖2 AOT對metMb溶液同步熒光光譜的影響Fig.2 Effects ofAOT on synchronous fluorescence spectra of metMbCmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;104CAOT/(mol·L-1):(a)0,(b)2.4,(c)3.0,(d)3.7,(e)4.4

圖3 SDBS對metMb溶液同步熒光光譜的影響Fig.3 Effects of SDBS on synchronous fluorescence spectra of metMbCmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;104CSDBS/(mol·L-1):(a)0,(b)0.6,(c)1.3,(d)1.5,(e)1.9

3.2 陽離子型表面活性劑

圖4A是用5×10-2mol·L-1的CTAB滴定濃度為8×10-6mol·L-1的metMb的UV-Vis吸收光譜.可以看出,在CTAB濃度小于2×10-4mol·L-1時,并沒有使metMb出現Soret帶的紅移現象,也沒有出現規則的Q帶新峰,相反,隨著CTAB濃度的增加,Soret帶沒有伴隨著吸收強度的降低而發生移動,與此同時,630 nm處LMCT帶的吸收峰逐漸被掩蓋.當CTAB濃度達到2.25×10-4mol·L-1后,Soret帶藍移至約400 nm,濃度繼續增加,603 nm處heme單體的特征吸收峰出現,19意味著Fe-His-93位的鍵斷裂,底物配位由羥基替代,5-cHs的血紅素結構生成,也就是heme從metMb分子中脫離出來.與陰離子型表面活性劑相比,CTAB可以直接作用于metMb的血紅素中心,并不與His-64作用或作用很小,沒有形成6-cLs的hemichrome結構,而是使aquomet Mb中的血紅素脫離出來.

同為陽離子型表面活性劑,DTAB與CTAB對metMb的UV-Vis吸收光譜影響作用具有一些共同特征:隨著DTAB濃度的升高,出現了603 nm處的heme特征峰(見圖4B),與metMb的作用也沒有使蛋白形成6-cL結構.但由于metMb的等電點和卟啉環結構,以及DTAB自身結構特點等原因,反映其有自己的光譜特征,且DTAB的臨界膠束濃度(cmc)值比CTAB的高,所以作用濃度也較CTAB大(所用DTAB的滴定濃度為1 mol·L-1).DTAB濃度小于5.5×10-4mol·L-1時,促使metMb的Soret帶發生少許紅移(約1.5 nm),630 nm的LMCT帶被掩蓋,且出現明顯的527和563 nm的小峰,表明此時形成了一個中間態,具體是什么結構還有待進一步研究.繼續增大DTAB的濃度,522和563 nm處的峰強度逐漸減小,在603 nm處heme單體特征峰也出現,表明heme從疏水腔解離出來.對于陽離子表面活性劑而言,濃度低于其臨界膠束濃度時,其單體形式的分子對吸收光譜沒有影響,濃度高時形成聚合體或膠束才能與蛋白發生作用.20另外,在實驗所用的緩沖體系中,metMb卟啉環外露的羧酸根電離,蛋白整體呈負電性,其與陽離子型表面活性劑之間存在強烈的靜電吸引作用,再加上隨后的疏水作用,15所以DTAB和CTAB對metMb的作用比AOT和SDBS強,可以使metMb中心的heme從疏水腔中解離出來.

圖4 CTAB(A)及DTAB(B)對metMb溶液UV-Vis吸收光譜的影響Fig.4 Effects of CTAB(A)and DTAB(B)on UV-Vis absorbance spectra of metMbCmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;(A)104CCTAB/(mol·L-1):(a)0,(b)1.25,(c)2.00,(d)2.25,(e)2.50,(f)3.00,(g)3.50,(h)10.00,(i)12.00; (B)104CDTAB/(mol·L-1):(a)0,(b)4.0,(c)4.5,(d)5.0,(e)5.5,(f)7.0,(g)10.0,(h)12.0,(i)14.0

圖5A和5B分別是用5×10-2mol·L-1CTAB滴定8.0×10-6mol·L-1的metMb在Δλ=60 nm和Δλ=20 nm時的同步熒光光譜.由于CTAB對于metMb的同步熒光光譜影響較強,所以檢測時用的靈敏度選擇low.當CTAB濃度較低(小于1×10-4mol·L-1)時,對metMb的Tyr和Trp微環境就能產生較強影響,熒光強度顯著增強,且伴隨著最大發射峰的紅移,Trp的熒光強度變化更強一些.Δλ=60 nm時也出現351 nm的肩峰,形成的配位體系同樣對metMb中Trp-7和Trp-14殘基微環境極性的影響不同.CTAB的濃度逐漸增大,形成越來越多的膠束,膠束的形成可以降低Trp和血紅素之間的能量傳遞,表面疏水血紅素被溶解在膠束的疏水腔中,使得血紅素和Trp之間的距離越來越遠,他們之間的能量傳遞也被削弱,根據F?rster能量轉移理論,Trp與血紅素之間的距離增加將使得血紅素的熒光被減弱,metMb的熒光強度增加也變得緩慢.10同理,DTAB也使得metMb中的Trp熒光強度越來越強(見圖6A),由于DTAB的cmc值較高,所以對蛋白Trp微環境影響所需濃度比CTAB要高.圖5B和圖6B顯示Tyr的微環境也受到影響,最大發射峰也發生紅移,極性增強;隨著CTAB和DTAB的升高,最大發射峰仍很明顯,并沒有變得越來越平緩,是因為陽離子型表面活性劑存在時,Tyr-103上的Ph－OH并沒有變成Ph－O-形式.最大發射峰有少許紅移,說明Trp暴露到更強的極性環境中.與AOT和SDBS相比,CTAB和DTAB對metMb芳香族氨基酸微環境的影響更強,濃度不斷增高時可以使血紅素逐漸暴露.

圖5 CTAB對metMb溶液同步熒光光譜的影響Fig.5 Effects of CTAB on synchronous fluorescence spectra of metMbCmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;104CCTAB/(mol·L-1):(a)0,(b)1.0,(c)2.0,(d)5.0,(e)12.0

3.3 兩性離子型表面活性劑

CHAPS是一種兩性離子型表面活性劑,具有陰、陽兩種離子性質,但在中性pH環境中呈非電離子性質.圖7A顯示了CHAPS對metMb UV-Vis吸收光譜的影響,可以看出CHAPS濃度達到6.1×10-3mol·L-1,檢測結果顯示其對metMb仍沒有直接的作用,對Soret帶、Q帶及LMCT帶均沒有影響,不會形成hemichrome或者5-cLs的結構.此結果的主要原因是CHAPS在中性條件下成非電離子性質,整體呈電中性,降低了與蛋白質的陰離子性或者陽離子性位點作用的能力,同時也表明在中性pH條件下, metMb的陰離子位點和陽離子位點之間的距離相對較遠.21如果這些位點相對近一些,CHAPS應該比陰離子型或陽離子型表面活性劑對蛋白有更強的作用,因為每個CHAPS分子都既含有陰離子結合位點也含有陽離子結合位點,可以同時與蛋白有兩種離子作用.整體呈電中性,CHAPS的這種兩性離子性質降低了作為任何一種電荷性質與metMb之間的作用.沒有靜電作用時,表面活性劑與蛋白之間的疏水作用很弱,且難形成.

圖6 DTAB對metMb溶液同步熒光光譜的影響Fig.6 Effects of DTAB on synchronous fluorescence spectra of metMbCmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;(A)103CDTAB/(mol·L-1):(a)0,(b)3.0,(c)4.0,(d)5.0,(e)12.0

圖7 CHAPS對metMb溶液UV-Vis吸收光譜(A)和同步熒光光譜(B)的影響Fig.7 Effects of CHAPS on UV-Vis absorbance(A)and synchronous fluorescence spectra(B)of metMbCmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;103CCHAPS/(mol·L-1):(a)0,(b)0.49,(c)1.5,(d)2.4,(e)4.3,(f)6.1

圖7B為CHAPS對metMb同步熒光光譜圖,同紫外結果一致,其濃度達到6.1×10-3mol·L-1,Δλ=60 nm和Δλ=20 nm(插圖)時,metMb同步熒光光譜均沒有發生變化,也就是血紅素周圍微環境和芳香族氨基酸Tyr和Trp的微環境均不受其影響,CHAPS與metMb基本沒有發生作用或作用很小.

另外,非離子表面活性劑沒有離子性質,也不會與蛋白質發生靜電作用,與蛋白沒有直接的相互作用所以也不會是蛋白結構發生變化.22

3.4 各類表面活性劑對蛋白質二級結構影響

UV-Vis吸收光譜主要集中于研究血紅素口袋周圍環境變化,同步熒光光譜研究的是芳香族氨基酸微環境的變化,為了更深一步了解表面活性劑與蛋白質之間的作用過程,我們用遠紫外區圓二色譜(CD)技術檢測了metMb的二級結構變化情況，并用楊氏方程算法23計算Mb中的α螺旋、β折疊等含量變化.圖8A為metMb與AOT反應的遠紫外CD譜圖,在208和222 nm兩個負槽,反映的是α螺旋的光譜特性.24可以很明顯地看出,隨著AOT濃度的升高,負槽的強度逐漸減弱,metMb的α螺旋含量從74%減少到63%,同時,β折疊含量增加了近14%.同紫外-可見圖譜檢測的結果相對應,AOT改變metMb蛋白的血紅素中心配位的同時也改變蛋白的二級結構,但形狀和肩峰的位置未發生明顯改變,整個蛋白分子結構依然以α螺旋為主,說明蛋白在測定范圍內沒有變性,但是結構有較大變化(大于5%).這主要是由于AOT結合到metMb表面,使蛋白伸展并暴露出疏水殘基,干擾蛋白的螺旋結構,更多的β折疊及無規則卷曲可溶性暴露結構出現,同屬于陰離子型表面活性劑的SDBS對蛋白的二級結構影響規律也如此(圖未給出).

圖8B是CTAB滴定metMb得到的CD譜圖,結果顯示CTAB濃度為1×10-4mol·L-1時,metMb的二級結構已經發生很大變化,比陰離子型表面活性劑對蛋白的二級結構影響更強一些,α螺旋含量減少幅度也較大,繼續增大CTAB濃度,血紅素從疏水口袋逐漸暴露出來的同時,蛋白的整個二級結構也發生變化,整個過程中α螺旋含量減少了近20%,β折疊含量增加了34%,但蛋白骨架結構仍以α螺旋為主.DTAB濃度的升高也會使得蛋白的α螺旋含量減少,趨勢與CTAB的相似(圖未給出).

圖8 metMb與AOT(A)、CTAB(B)及CHAPS(C)相互作用的CD譜圖Fig.8 CD spectra of interactions of metMb withAOT(A)、CTAB(B)and CHAPS(C)CmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;(A)104CAOT/(mol·L-1):(a)0,(b)1.3,(c)5.4,(d)6.7,(e)8.1,(f)9.4; (B)104CCTAB/(mol·L-1):(a)0,(b)1.0,(c)2.0,(d)4.0,(e)8.0,(f)10.0;(C)103CCHAPS/(mol·L-1):(a)0,(b)0.49,(c)1.5,(d)2.4,(e)4.3,(f)6.1

圖8C顯示在測定的濃度范圍內,加入CHAPS前后,此metMb的二級結構沒有變化,以α螺旋結構為主,此結果同紫外、熒光光譜結果一致,充分說明CHAPS沒有與metMb發生相互作用,對蛋白質的天然狀態不產生影響.

4 結論

當溶液的pH值大于蛋白質的等電點時,蛋白質表面呈現負電性,所以其與不同類型的表面活性劑作用所呈現的性質不同.本文在模擬人體的弱堿性緩沖體系(pH 7.4)中比較研究了三類表面活性劑與metMb相互作用的不同機理.陰、陽離子型表面活性劑通過靜電作用和疏水作用,主要是靜電作用,與metMb都發生了直接相互作用,且改變metMb中心卟啉環的微環境.陽離子型表面活性劑的作用更強一些,這種改變依賴于表面活性劑的濃度,而兩性離子表面活性劑CHAPS對蛋白質的結構基本不產生影響.陰、陽離子型表面活性劑也表現出不一樣的特征,AOT和SDBS主要通過靜電斥力將aquometMb轉變成hemichrome結構,且對Trp和Tyr的微環境均有影響,同時影響metMb的二級結構,使其α螺旋含量逐漸減少,β折疊含量增加;陽離子表面活性劑CTAB和DTAB與metMb的作用更強一些,主要作用力為靜電吸引作用,隨著表面活性劑濃度的升高,并未出現AOT和SDBS與metMb相互作用過程中產生的6-cLs配位結構,而是直接作用于血紅素中心,形成5-cLs結構,最終將血紅素暴露出來,且CTAB和DTAB對metMb的Tyr和Trp微環境作用強度也比AOT和SDBS強,對metMb的二級結構也影響也很大.CHAPS在中性pH條件下整體呈電中性,結果顯示其對metMb血紅素微環境、芳香族氨基酸及二級結構基本沒有影響,可以保護蛋白的天然狀態.

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July 29,2011;Revised:October 2,2011;Published on Web:October 13,2011.

Interactions between Different Classes of Surfactants and Metmyoglobin

ZHANG Ying-Ying1CAO Hong-Yu1,2TANG Qian1,2ZHENG Xue-Fang1,2,*
(1School of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian 116622,Liaoning Province,P.R.China;2Liaoning Key Laboratory of Bioorganic Chemistry,Dalian University,Dalian 116622,Liaoning Province,P.R.China)

Complexes of horse metmyoglobin(metMb)with the anionic surfactants sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinate(AOT)and sodium dodecyl benzene sulfonate(SDBS),the cationic surfactants dodecyl trimethylammonium bromide(CTAB)and dodecyltrimethyl ammonium bromide(DTAB),and the zwitterionic surfactant3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate (CHAPS)were investigated by UV-Vis absorption,synchronous fluorescence emission,and circular dichroism(CD) spectroscopy.Experimental results show that the anionic and cationic surfactants can interact with metMb intensively depending on the surfactant concentration.The UV-Vis spectra indicate that AOT and SDBS interact with metMb at low concentrations.The addition of AOT(or SDBS)causes the formation of a six-coordinated low-spin heme(6-cLs)hemichrome as is evident from the red shift of the Soret band,the intensity decrease,concomitant appearance of two new Q bands,and the disappearance of ligandto-metal charge transfer(LMCT).The surfactants disturb the Tyr and Trp microenvironment and change the second structure parameter of metMb while the α-helix content decreases.However,the interaction between metMb and CTAB(or DTAB)is different.They cannot disturb heme at very low concentrations but can disturb the Tyr and Trp microenvironment.CTAB and DTAB aggregates can convert metMb to a five-coordinated low-spin heme as shown by the blue shift of the Soret band and cause the heme monomer to leave the hydrophobic cavity of metMb through electrostatic attraction mainly.DTAB/metMb complexes behave in a slightly different way to CTAB/metMb because of their special structure.In contrast,no interaction is evident between the zwitterionic surfactant over a large range of concentrations because of the neutral charge of CHAPS,which precludes an effective electrostatic attraction between the ionic sites of CHAPS and a protein.The significant distance between the ionic sites with opposite charges in metMb precludes a double ionic interaction for each CHAPS surfactant molecule despite the presence of two oppositely charged ionic sites in the CHAPS molecule.Therefore,proteins interact with surfactants in multifarious ways and this depends on the surfactant species,concentration,and structure.

Anionic surfactant;Cationic surfactant;Zwitterionic surfactant;Metmyoglobin; Spectrometry

10.3866/PKU.WHXB20112907

?Corresponding author.Email:dlxfzheng@126.com;Tel:+86-411-87403720.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20871024),Project for Liaoning Innovation Teams in University, China(2006T002,2008T005,2009T003),Research Foundation of Education Bureau of Liaoning Province,China(2009A069,2009A071),and Project for Dalian Science and Technology,China(2008E11SF170).

國家自然科學基金(20871024),遼寧省高校創新團隊(2006T002,2008T005,2009T003),遼寧省教育廳(2009A069,2009A071)和大連市科技計劃(2008E11SF170)資助項目

O648;O629.73