棕頸鉤嘴鹛分子系統發育及分類關系初探

宋 蕊, 董 鋒, 劉魯明 吳 飛 王 凱 鄒發生, 雷富民, 李壽先, 楊曉君

(1. 中國科學院昆明動物研究所, 云南 昆明 650223; 2. 華南瀕危動物研究所, 廣東 廣州 510260;3. 中國科學院動物研究所, 北京 100101; 4. 臺灣師范大學 生命科學系, 臺灣 臺北 116; 5. 中國科學院研究生院, 北京 100049)

棕頸鉤嘴鹛分子系統發育及分類關系初探

宋 蕊1,5, 董 鋒1,5, 劉魯明1, 吳 飛1, 王 凱1, 鄒發生2, 雷富民3, 李壽先4,*, 楊曉君1,*

(1. 中國科學院昆明動物研究所, 云南 昆明 650223; 2. 華南瀕危動物研究所, 廣東 廣州 510260;3. 中國科學院動物研究所, 北京 100101; 4. 臺灣師范大學 生命科學系, 臺灣 臺北 116; 5. 中國科學院研究生院, 北京 100049)

棕頸鉤嘴鹛(Pomatorhinus ruficollis)各亞種間系統發育關系一直存在分歧。該文測定了棕頸鉤嘴鹛 10個亞種20個樣本的完整線粒體Cyt b和ND2基因序列(共2 184 bp), 以棕頸鉤嘴鹛(P. ruficollis)和灰頭鉤嘴鹛(P.schisticeps)為內群; 栗背鉤嘴鹛(P. montanus)、棕頭鉤嘴鹛(P. ochraceiceps)、紅嘴鉤嘴鹛(P. ferruginosus)和劍嘴鹛(Xiphirhynchus superciliaris)為外群, 通過最大簡約法、最大似然法以及貝葉斯推斷法, 構建了棕頸鉤嘴鹛亞種間的系統發育樹。結果顯示：棕頸鉤嘴鹛是并系群, 灰頭鉤嘴鹛聚合在其內部; 棕頸鉤嘴鹛可分為3個地理支序, 即中國西南部支序、中國東南部支序和中國中部支序；棕頸鉤嘴鹛亞種間系統發育關系與形態特征不完全一致, 并澄清了一些分類問題。

棕頸鉤嘴鹛；Cyt b；ND2；種下分類

棕頸鉤嘴鹛(Pomatorhinus ruficollis)隸屬雀形目(Passeriformes)鹟科(Muscicapidae)畫鹛亞科(Timaliinae)鉤嘴鹛屬(Pomatorhinus), 主要分布于東洋區中印亞區中北部以及喜瑪拉雅山南部(Sibley& Monroe, 1990), 分布海拔為200～3 000 m (Collar& Robson, 2007), 屬于林下層活動的鳥類, 其典型特征為具栗色的頸圈、白色的長眉紋和黑色的貫眼紋, 胸部具有縱紋或無紋。通過檢查中國科學院昆明動物研究所的館藏標本和結合現有文獻(Ramsay,1878; Cheng, 1962; Cheng et al, 1987; Yang & Yang,2004; Collar, 2006; Collar & Robson, 2007), 發現棕頸鉤嘴鹛種下的形態變化非常大, 僅依據胸紋就至少可以分為3個類群, 即胸部具黑褐色點斑的有P. r. musicus和P. r. nigrostellatus；胸部幾乎為白色的有P. r.bhamoensis、P. r. beaulieui和P. r.albipectus；胸部具橄欖褐色至深栗色縱紋的有P. r.bakeri、P. r. laurentei、P. r. styani、P. r. similes、P. r.godwini、P. r. eidos、P. r. stridulus、P. r. hunanensis和P. r. reconditus。對棕頸鉤嘴鹛種下形態殊異的亞種, 存在幾種不同分類意見：Ramsay(1878)曾將其劃分為3個種, 即P. ruficollis、P. nigrostellatus和P. musicus; 后來的分類處理均將其歸為P. ruficollis,最常見的是將其分為 14個亞種(Deignan, 1964;Clements, 2000; Dickinson, 2003)。Collar (2006)及Collar & Robson(2007)認為P. musicus較之P.ruficollis來說體型更大, 上嘴全黑且較長, 頭部深灰色, 后頸的栗色更寬更多, 胸紋為清晰的黑褐色的卵圓狀, 腹部和兩脅為明顯栗色, 可以作為一個獨立種; Collar (2006)認為雖然P. r. nigrostellatus的胸紋與P. musicus相似, 但其胸羽還保持有稀薄的白色邊緣，背側也與其它亞種相似, 因此，不提倡將P. r. nigrostellatus提升為種，從而將棕頸鉤嘴鹛分為兩個種：一個是含13個亞種的P. ruficollis; 一個是單型種P. musicus。然而, Dong et al (2010a)和Reddy & Moyle(2011)的分子研究結果均表明, 灰頭鉤嘴鹛(P. schisticeps)個體與棕頸鉤嘴鹛個體呈現嵌套關系并共同構成一個單系。目前的形態學和分子生物學的研究均說明，棕頸鉤嘴鹛各亞種的系統發育關系有進一步探討的必要。

本研究以線粒體DNA數據重構棕頸鉤嘴鹛的種下系統發育關系, 以檢驗Ramsay (1878)、Collar(2006)、Collar & Robson (2007)對本種的分類意見,了解該物種的演化歷史并完善其分類處理。同時,探討鳥類形態和環境的適應過程, 促進東南亞眾多形態存在高度差異物種的研究工作。

1 材料與方法

根據 Collar & Robson (2007)和 Cheng (1962)的分類建議, 在取樣時暫將P. r. laurentei、P. r. styani、P. r. musicus和P. r. nigrostellatus作為獨立亞種, 并根據Dong et al (2010a)的研究結果, 以棕頸鉤嘴鹛和灰頭鉤嘴鹛為內群; 以栗背鉤嘴鹛(P. montanus)、棕頭鉤嘴鹛(P. ochraceiceps)、紅嘴鉤嘴鹛(P.ferruginosus)和劍嘴鹛(Xiphirhynchus superciliaris)為外群, 構建線粒體細胞色素b(Cyt b)與NADH脫氫酶第二亞基(ND2)兩個基因合并數據集的系統發育樹。

1.1 樣本采集及總DNA的提取

除P. r. godwini外, 采集到在國內分布的棕頸鉤嘴鹛有10個亞種, 20個樣本。樣本保存于99%的酒精分析純溶液中, 并存放于?80 ℃冰箱?？侱NA的提取采用經典的異丙醇沉淀法, 提取后的 DNA經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。灰頭鉤嘴鹛、栗背鉤嘴鹛、棕頭鉤嘴鹛、紅嘴鉤嘴鹛和劍嘴鹛的序列均下載自GenBank, 所有樣本的標本號及采集地見表1。KIZ：中國科學院昆明動物研究所; SCIEA：華南瀕危動物研究所;NTNU：臺灣師范大學; IOZ：中國科學院動物研究所; GenBanka～d來自Dong et al (2010a); GenBanke來自 Cibois (2003)和 Pasquet et al (2006)。KIZ: Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences;SCIEA: South China Institute of Endangered Animals; NTNU, National Taiwan Normal University; IOZ: Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences; GenBanka?dcame from Dong et al (2010a); GenBankecame from Cibois (2003) and Pasquet et al (2006).

表1 本研究中的樣品及其來源Tab. 1 Sample species and source in this study

1.2 目的基因的擴增及序列測定

分別使用兩對引物(表2)對線粒體Cyt b和ND2基因進行擴增, PCR擴增產物測序時, 使用同樣的引物。PCR反應體系(50 μL體系)為：雙蒸水38.5 μL,10×PCR Buffer 5 μL, dNTP 3 μL(2.5 mmol/L), 小牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)2 μL, 正反引物各1 μL(10 m mol/L), Taq DNA聚合酶0.25 μL,模板DNA 1 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min; 以94 ℃變性30s 、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸1 min為1個循環, 共進行35個循環; 循環結束后72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送交測序公司進行雙向測序。

表2 本研究使用的引物列表Tab. 2 Primers used in this study

1.3 數據分析

測序得到的序列片段使用 DNASTAR軟件包(DNASTAR Inc, Madison, WI)中的SeqMan程序進行正反向拼接并校正。拼接后的序列在 Clustal X 1.83(Thompson et al, 1997)中使用默認參數進行對位排列。遺傳距離在MEGA 4.0(Tamura et al, 2007)中計算。

使用PAUP* 4.10b (Swofford, 1999)、Phyml 3.0(Guindon & Gascuel, 2003)和MrBayes 3.1.2(Huelsenbeck & Ronquist, 2001)分別構建最大簡約樹(MP樹)、最大似然樹(ML樹)和貝葉斯推斷樹(BI樹)。MP樹是采用啟發式搜索(heuristic research), 分支交換算法是使用樹二等分再連接法(treebisection-reconnection), 各分支節點的可靠性使用1 000次重復的自展重抽樣值——Bootstrap support,BS (Felsenstein, 1985)進行評估; 構建ML和BI樹之前, 在 Modeltest 3.7 (Posada & Crandall, 1998)中進行合并數據集的模型檢測, 根據赤池信息量準則(Akaike Information Criterion, AIC)選擇最適核酸置換模型為 GTR+G (-lnL=6705.8291,K=9, AIC=13429.6582)。ML樹在Phyml 3.0中計算, 堿基頻率在最大似然框架(the maximum likelihood framework)下估計, 分支交換算法設為 SPR(subtree pruningregrafting), 樹的搜索完成后也采用 1 000次的自展重抽樣值——Bootstrap support, BS (Felsenstein,1985)評估各分支節點的可靠性, 其余選項選用系統默認參數; BI分析采用與 ML相同的模型, 在MrBayes 3.1.2中同時運行2個獨立的由4條鏈組成的Metropolis-coupled Markov Chain Monte Carlo程序, 每個程序運行500萬 代, 每隔100代進行一次抽樣, 分支置信度用后驗概率(Posterior probability,PP) 表示。

2 結 果

測序獲得全部20個樣本的完整Cyt b和ND2基因(Cyt b:1 143 bp;ND2: 1 041 bp)。在SeqMan程序中使用脊椎動物線粒體密碼子將基因序列翻譯成氨基酸序列, 在氨基酸序列中未發現終止密碼子和空位。因此, 得到的Cyt b和ND2基因全長序列均應來自線粒體DNA, 而非核假基因。

2.1 系統發育分析

使用MP法、ML法和BI法三種方法構建的系統發育樹的拓撲結構完全一致(圖 1), 且大部分節點都得到了較高的支持率(BS＞70%, PP＞0.95)。

MP樹、ML樹和BI樹均顯示棕頸鉤嘴鹛不是單系群, 灰頭鉤嘴鹛位于其系統發育樹的內部, 并以較高的支持率(MP BS=75, ML BS=86, BI PP=0.98)與云南地區的棕頸鉤嘴鹛聚合為一支。同時, 系統樹也顯示棕頸鉤嘴鹛各個亞種可穩定地分為3個支序, 即支序A(Clade A)、支序B(Clade B)和支序C(Clade C)。

圖1 基于線粒體DNA序列合并數據集構建的50% MP一致樹Fig. 1 50% MP tree based on the concatenated dataset of mitochondrial DNA sequence

Clade A (MP BS=85, ML BS=81, BI PP=1.00)包括P. r. albipectus、P. r. similis和P. r. laurentei, 這3個亞種在國內均分布在云南。值得注意的是P. r.laurentei的兩個樣本并沒有聚為一支, 其中一個樣本聚合在P. r. similis內部(MP BS=96, ML BS=97, BI PP=1.00), 再共同與P. r. albipectus聚為姐妹群(MP BS=94, ML BS=95, BI PP=1.00)。

Clade B (MP BS=62, ML BS=75, BI PP=0.81)由P. r. musicua、P. r. nigrostellatus、P. r. stridulus和一個P. r. reconditus樣本構成, 主要分布于廣東、福建、江西、浙江、臺灣、海南等地。比較意外的是分布于云南東南部的P. r. reconditus的一個樣本也位于Clade B中, 并與P. r. stridulus聚為姐妹群, 但是支持率不高(MP BS=61, ML BS=62, BI PP=0.74)。

Clade C (MP BS=99, ML BS=94, BI PP=0.97)包括P. r. eidos,P. r. hunanensis,P. r. styani和P. r.reconditus的另一個樣本, 分布范圍集中在四川、湖南、湖北、甘肅、陜西、河南、江蘇、安徽、廣西、貴州等地。同Clade B一樣, Clade C中也聚合了P. r.reconditus的一個樣本, 但因支持率較低, 未能解決其在Clade C中的具體位置。

2.2 遺傳距離

在MEGA 4.0中采用K2P(Kimula 2- Parameter)模型獲得未經校正的遺傳距離。計算內外群間的平均遺傳距離時以最近外群P. montanus為代表, 所得平均遺傳距離為9.0%; 內群中3個支序之間的平均遺傳距離分別為 Clade A/Clade B=3.5%、Clade A/Clade C=2.4%和Clade B/Clade C=3.6%; 各支序內部樣本間的遺傳距離分別為0.8%、1.9%和0.5%;灰頭鉤嘴鹛與各支序(Clade A至C)之間的平均遺傳距離分別為1.8%、3.5%和2.3%。

3 討 論

研究結果顯示，棕頸鉤嘴鹛不是單系群, 灰頭鉤嘴鹛位于其系統發育樹的內部; 棕頸鉤嘴鹛可分為明顯的3個支序, 且各支序內部的遺傳距離(0.8%,1.9%, 0.5%)較之各支序之間的遺傳距離(3.5%,2.4%, 3.6%)要小得多; 同時P. r. musicus和P. r.nigrostellatus也均位于一個支序的內部。以上結果既不同于Ramsay (1878)將棕頸鉤嘴鹛劃分為3個種, 也不同于Collar (2006)和Collar & Robson (2007)劃分為兩個種的建議。

3.1 灰頭鉤嘴鹛與棕頸鉤嘴鹛的關系

灰頭鉤嘴鹛位于系統發育樹的內部, 與棕頸鉤嘴鹛P. r. albipectus、P. r. similis和P. r. laurentei的親緣關系非常近(遺傳距離為 1.8%), 比棕頸鉤嘴鹛3個支序之間2.4%～3.6%的差異程度還要低。從形態上看, 灰頭鉤嘴鹛與棕頸鉤嘴鹛也非常相似, 兩者僅以胸部有無縱紋相區別。已有研究表明, 灰頭鉤嘴鹛與棕頸鉤嘴鹛在老撾中、北部存在雜交現象(Delacour & Greenway, 1940; Duckworth et al,1998)。本文中的灰頭鉤嘴鹛樣本來自臨近泰緬邊界的翁旁(Umphang), 與已知的雜交帶相距較遠, 在形態特征上亦為典型的灰頭鉤嘴鹛, 但仍然與云南的棕頸鉤嘴鹛表現出較近的親緣關系。因此, 兩者的系統發育關系, 尚需擴大取樣進行進一步的研究。

3.2 P. r. musicus和P. r. nigrostellatus的分類學地位

P. r. musicus與P. r. nigrostellatus均位于Clade B中, 并沒有分別構成與其它亞種相對獨立的支序。P. r. musicus同CladeA/B/C之間的遺傳差異分別為 3.3%、3.5%和 3.5%, 遠小于內外群的種間差異 9.0%。依據系統發育種的定義, 如果承認P. r.musicus為獨立種, 則應將棕頸鉤嘴鹛重新分割為至少4個種; 如果承認P. r. nigrostellatus為獨立種,則更應將棕頸鉤嘴鹛細分為 5個以上的種, 而非Ramsay(1878)所劃分的3個種, 也非Collar (2006)、Collar & Robson (2007)所提議的2個種。因此, 本文不完全支持Ramsay (1878)、Collar (2006)和Collar& Robson (2007)對棕頸鉤嘴鹛的分類意見。

3.3 P. r. laurentei和P. r. styani的分類地位

Cheng et al (1987)認為P. r. laurentei是P. r.reconditus的同物異名, 應將P. r. laurentei歸為P. r.reconditus; Yang & Yang (2004)更是將其歸為P. r.reconditus、P. r. albipectus和P. r. reconditus3亞種的居間類群。本文結果顯示,P. r. laurentei與P. r.reconditus分別位于不同的支序中(Clade A與Clade B、C), 兩者的遺傳距離為 2.7%, 親緣關系較遠。通過查看中國科學院昆明動物研究所的館藏標本,發現P. r. laurentei的背部和胸紋均呈橄欖褐色, 上嘴幾乎為黃色, 形態特征與P. r. similis比較接近;而P. r. reconditus的背部和胸紋均呈栗色, 上嘴基部為黑色, 與P. r. laurentei有明顯區別。因此, 不支持Cheng et al (1987)的觀點。

從發育樹上還可以看出,P. r. laurentei的2個樣本并未單獨聚為一支, 一個樣本位于Clade A的根部(MP BS=85, ML BS=81, BI PP=1.00); 而另一個樣本則位于Clade A的內部并與P. r. similis聚合(MP BS=96, ML BS=97, BI PP=1.00), 顯示其有一定的分化, 或者是否如Yang & Yang (2004)所推測的為雜交類群, 需進一步的研究證明。

P. r. styani長期以來一直作為P. r. stridulus的同物異名(Diegnan, 1964; Dickinson, 2003), 但Cheng et al (1987)和Collar & Robson (2007)認為兩者區別明顯, 應當作為獨立的亞種。本文的結果顯示，P. r.styani和P. r. stridulus分別位于不同的支序中, 兩者間的遺傳差異為 4.0%, 與各支序之間的差異程度相當; 從形態上來看,P. r. styani的背部及胸紋均呈橄欖褐色, 而P. r. stridulus的背部及胸紋均呈栗色,區別比較明顯; 另外,P. r. styani主要分布在長江流域, 而P. r. stridulus集中在東南沿海地區, 兩者分布區基本無重疊。因此, 本文支持Cheng et al(1987)和Collar & Robson(2007)的觀點, 認為P. r. styani是獨立的亞種。

3.4 棕頸鉤嘴鹛亞種形態與發育關系

從構建的系統發育樹看, 棕頸鉤嘴鹛的3個支序在地理分布上明顯可分為3個地理類群, 即中國西南部類群Clade A、中國東南部類群Clade B和中國中部類群Clade C, 該結果與灰眶雀鹛(Zou et al,2007; Song et al, 2009)的地理類群分布基本一致,揭示這3個地區在生物分布與系統發生中可能存在更深入的關系。

Ramsay (1878)曾指出, David & Oustalet (1877)已發現棕頸鉤嘴鹛在羽色上有相當大的變異。經比對館藏標本, 發現棕頸鉤嘴鹛的3個支序在形態上有一定的重疊, 不具有明顯的可區分特征, 同一個支序中亞種間的羽色變化也很大, 尤其以胸紋為甚,如在Clade A中,P. r. albipectus的胸紋幾乎為白色,有時僅具細微淡黃色, 但P. r. similis卻為較淺的橄欖褐色胸紋; 在Clade B中,P. r. stridulus的胸紋為深栗色, 但P. r. nigrostellatus和P. r. musicus卻為黑色斑塊狀胸紋; Clade C中,P. r. hunanensis的胸紋是栗色, 而P. r. styani的胸紋則呈橄欖褐色。由此可見,對棕頸鉤嘴鹛來說, 亞種間的形態特征與其地理分布和發育關系并不相對應。這與在美國布萊克沃特國家野生動物保護區(Blackwater National Wildlife Refuge, NWR)越冬的來自不同繁殖地的兩群雪雁(Chen caerulescens caerulescens)一樣, 雖然它們形態上有明顯的區別, 卻不存在遺傳差異(Humphries et al, 2009); 同樣, 山椒鳥屬(Pericrocotus)鳥類羽色和體型相近的種，并不意味著具有更近的親緣關系(J?nsson et al, 2010)的研究結果也與本文相似。這暗示著鳥類的羽色變化較其遺傳結構變化更為容易,鄰近區域中的種群可能由于環境壓力或性選擇差異而分化出不同的羽色, 而不同的地理類群又可能因趨同進化形成近似的羽色。因此, 不能僅依據體色的變化對其進行分類或推測其親緣關系。

在鳥類中, 大多數姐妹種的Cyt b基因的遺傳差異在 2%以上(Johns & Avise, 1998); Hebert et al(2004)的研究也表明, 鳥類中同種個體間COI基因的平均差異是0.29%, 而在同屬的種間為7.05%。從本文構建的系統發育結果來看, 棕頸鉤嘴鹛已經開始逐漸分化為幾個穩定的支序, 但支序之間的遺傳差異在 2.4%～3.6%之間, 遠小于同外群的平均種間差異(9.0%)。同時,3種方法構建的系統發育樹均穩定地將灰頭鉤嘴鹛聚合在棕頸鉤嘴鹛的內部, 亦將P. r. reconditus劃分到了不同的類群中(CladeB和C)。中國科學院昆明動物研究所館藏標本中, 云南昭通和文山采自同一地點的P. r. reconditus標本在胸紋上都存在橄欖褐色與栗色兩種形態, 這一結果與Zink (2004)指出的傳統亞種劃分并不能完全體現物種內部正確的遺傳結構和地理格局分化的觀點相符。本研究的結果暗示棕頸鉤嘴鹛各亞種間的系統發育關系是非常復雜的, 有必要進行更加深入和系統的分析。

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Preliminary discussion on the phylogenetic and taxonomic relationship ofPomatorhinus ruficollis

SONG Rui1,5, DONG Feng1,5, LIU Lu-Ming1, WU Fei1, WANG Kai1, ZOU Fa-Sheng2,LEI Fu-Min3, LI Shou-Hsien4,*, YANG Xiao-Jun1,*

(1.Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Kunming Yunnan650223,China; 2.South China Institute of Endangered Animals,Guangzhou510260,China; 3.Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing100101,China; 4.Department of Life Science, National
Taiwan Normal University, Taipei116,China;5.Graduate University of the Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China)

The phylogenetic relationships among subspecies ofPomatorhinus ruficollisare not clear. In this paper we sequenced two mitochondrial genes (Cyt bandND2, in total 2 184 bp) and examined twenty individuals representing ten of the eleven subspecies ofP. ruficollisin China. Molecular phylogenetic trees were reconstructed using maximum parsimony, maximum likelihood and Bayesian inference methods, withP. ruficollisandP. schisticepsas in-groups,P.montanus,P. ochraceiceps,P. ferruginosusandXiphirhynchus superciliarisas out-groups. Results indicated thatP.ruficolliswas paraphyletic, in whichP. schisticepswas embedded, and was divided into three phylogeographic groups:southwestern China group, southeastern China group and central China group. Our results also suggested discordances between phylogenetic relationships and morphological characteristics, and clarified some intraspecific taxonomic debates.

Pomatorhinus ruficollis;Cyt b;ND2; Phylogeny

Q959.739； Q959.739.09

A

0254-5853-(2011)03-0241-07

10.3724/SP.J.1141.2011.03241

2010-12-06；接受日期：2011-02-28

國家自然科學基金 (30870279); 國家自然科學基金國際(地區)合作與交流項目 (31010103901); 瀾滄江中下游與大香格里拉地區科學考察項目 (2008FY110300); 中國科學院對外合作重點項目 (GJHZ200822)

?通訊作者(Corresponding author)，E-mail: t43028@gmail.com, yangxj@mail.kiz.ac.cn

女, 碩士研究生, 主要從事鳥類分子系統發育研究