大鼠眶額葉GABA及其B型受體在應激性抑郁行為發生中的作用及其影響機制

谷朝陽, 安書成

(陜西師范大學 生命科學學院, 陜西 西安 710062)

大鼠眶額葉GABA及其B型受體在應激性抑郁行為發生中的作用及其影響機制

谷朝陽, 安書成*

(陜西師范大學 生命科學學院, 陜西 西安 710062)

為了探討眶額葉(orbital frontal cortex, OFC)GABA及其B型受體在應激性抑郁行為發生中的作用及其影響機制, 實驗采用強迫游泳方法建立急性應激抑郁模型。在OFC區 微量注射γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)及其B型受體阻斷劑, 通過開場實驗、強迫游泳方式檢測動物行為學表現, 用免疫組織化學染色和Western blotting方法檢測OFC區 Kalirin表達, 用高爾基染色法觀察錐體細胞樹突和樹突棘。結果顯示：強迫游泳應激引起動物抑郁樣行為表現, 同時, OFC區 Kalirin陽性顆粒數及表達量顯著減少, 且錐體細胞樹突棘密度下降; OFC區微量注射GABA具有抗抑郁效應, 使OFC區 Kalirin表達顯著升高, 錐體細胞樹突棘密度增加; GABA-B型受體阻斷劑CGP35348可以抑制GABA的這種效應。由此可見, 通過強迫游泳應激誘發的抑郁樣的行為變化與OFC區 Kalirin表達減少和神經元樹突棘密度降低有關, GABA可能通過GABA-B型受體增加OFC區 Kalirin表達, 以防止神經元退行性變化而產生抗抑郁作用。

強迫游泳; 抑郁癥; 應激; Kalirin-7; γ-氨基丁酸; 樹突棘

抑郁癥是情感性精神障礙的主要類型, 隨著社會競爭與工作和生活壓力的增加, 其發病率有逐年升高趨勢, 國際衛生組織已將其列為影響人類健康最嚴重的十大疾病之一。有關抑郁癥發病機制的研究也已受到廣泛的關注。Jayatissa et al(2008)研究表明, 應激是誘發抑郁癥的重要因素之一, 應激誘發抑郁涉及到額葉、海馬、杏仁核、腹側背蓋區等多個腦區及核團。眶額葉(orbital frontal cortex, OFC)作為前額葉的一個重要區域, 與情緒、認知功能密切相關。然而, 關于OFC與抑郁發生的研究卻相對較少。Bremner et al (2002)研究提示, OFC在抑郁行為產生中也具有重要作用。抑郁癥患者表現出行為上認知能力的缺陷及決策判斷力的下降或異常, 且多數老年患者OFC體積變小, 神經元萎縮。對抑郁癥的某些藥物和心理治療可以改善抑郁患者 OFC退行性變化(Castren & Rantamaki, 2010; Altena et al,2010; Bremner et al, 2002)。這些結果提示OFC參與了抑郁的發生。目前關于抑郁發生與抗抑郁的神經機制研究提出了單胺類遞質與受體失調學說、谷氨酸及其受體學說、神經可塑性學說等多種解釋, 而對于γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)的研究相對較少。有研究顯示, 抑郁發生與腦脊液和血液GABA水平下降相關; 也有研究顯示, GABA的不同受體在抑郁發生與抗抑郁中的作用不同(Chu &Hablitz, 2003; Drugan, et al, 1989; Feng et al, 2006;Kita et al, 2006; Kosel et al, 2004; Wang et al, 2003),GABA-B受體敲除有抗抑郁效應(Mombereau et al,2004), 且 B型受體激活可能影響其他與抑郁相關的神經遞質, 并且GABA-B受體的行為效應存在較大區域差異(Cryan & Kaupmann, 2005)。總之,GABA與抑郁發生的具體機制仍未明確。GABA是一種在 OFC廣泛分布的重要神經遞質, 參與了焦慮和抑郁等精神障礙的形成。由于目前研究較少,且臨床研究和實驗研究結果尚有不一致之處。因此,OFC區 GABA及其B受體與抑郁發生的具體機制,以及應激是否通過 GABA改變神經元形態而誘發抑郁等還都不清楚。Kalirin-7 是位于樹突棘上, 與神經元結構、樹突棘形態有重要關系的因子。Kairin-7表達變化與神經元形態結構可塑性變化密切相關。因此, 我們通過強迫游泳應激, 建立急性應激性抑郁模型, 探討OFC區 GABA及其 B型受體與應激性抑郁發生的關系, 以及GABA是否經B型受體, 通過 Kalirin-7影響或調節神經元形態, 尤其是樹突和樹突棘而發揮抗抑郁作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性SD大鼠(220～250 g)40只, 購自陜西省中醫研究院動物中心。自由進水進食。環境溫度和濕度維持在(22±1)℃和(52±2)%, 動物飼養于 12/12 h明暗周期環境。

動物分為4組：對照組(control)、15 min強迫游泳組(saline)、GABA微量注射組(GABA組), 以及CGP35348和GABA微量注射組(CGP組)。動物在實驗前適應環境7 d, 每天撫摸5 min。

1.2 主要試劑

GABA、CGP35348購于美國 Sigma公司,Kalirin-7抗體由美國康涅狄格州大學贈送, SABC試劑盒和 DAB試劑盒均為武漢博士德生物技術工程有限公司產品。

1.3 方 法

1.3.1 腦定位與微量注射 大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg), 俯臥位固定于 WDT-Ⅱ型立體定位儀(美國, Stoelting), 參照 Paxinos &Watson 大鼠腦圖譜, 按照定位程序, 向 OFC(AP 3.7 mm, RL 2.4 mm, H3.5 mm)(圖1)植入帶有內芯的不銹鋼套管作為微量注射通道, 以牙科水泥固定,外層用牙托粉加固, 完成后將動物保持在(30±2)℃溫暖環境直至蘇醒。手術后每日腹腔注射2萬單位盤尼西林, 持續3 d, 自由進食飲水。手術后, 恢復至少一周。每組動物均進行兩次注射, 間隔時間均為10 min。control組和saline(15 min強迫游泳)組注射兩次生理鹽水(0.5 μL/次); GABA組注射0.5 μL生理鹽水后, 再注射 0.5 μL GABA(20 mg/mL)；CGP組先注射0.5 μL GABA(20 mg/mL)后, 注射0.5 μL CGP35348(40 mg/mL, σ)。所有注射在行為測試前30 min進行, 手動注射速度為0.5 μL/min, 注射完成后停針1 min, 使藥物充分吸收。

圖1 微量注射位置示意圖(標尺：2 000 μm)Fig. 1 Microinjection site (Scale bar, 2 000 μm )

1.3.2 強迫游泳模型 如Porsolt et al (1977)所描述,動物放入一個透明水缸(40 cm高, 直徑20 cm), 缸內水深為(31.5±1.5)cm，水溫為(24±0.5) ℃, 水面距缸上緣 10 cm, 保證動物在缸內游泳時身體不會支撐在缸底面。除control組動物外, 其他組均在腦定位手術后第8 d進行15 min強迫游泳預備游, 用秒表記錄前10 min內, 動物不動時間, 若持續不動或持續攀爬則棄去不用。24 h后進行上述微量注射和正式FST實驗。

1.4 行為實驗

1.4.1 開場實驗 所有行為測試在上午 7點到 11點之間在暗光環境進行。實驗前將動物放置于行為測試室，至少1 h適應環境。實驗裝置大小規格為60 cm×60 cm×40 cm, 四周和底面均為黑色, 底面以淡色線分為25個12 cm×12 cm小格。每只動物測試時放入開場中央適應30 s, 然后用攝像頭記錄5 min時間內的動物總穿越格數, 即水平運動(locomotor activity)、站立(rearing)次數、修飾(grooming)次數以及中央格停留時間(central time)。每次測試后用90%酒精擦干凈測試箱, 除去動物氣味影響。

1.4.2 強迫游泳測試 手術后第9天, 進行正式游泳測試, 實驗環境條件與預備游時相同。5 min內,記錄動物不動時間(immobility)以及攀爬(climbing),以動物不動時間作為判斷抑郁嚴重程度的指標,并用數碼攝像頭記錄視頻; 每只動物測試后清洗干凈水缸, 換水, 避免對下一只動物的影響。

1.5 形態學及免疫學實驗

1.5.1 高爾基染色法觀察神經元形態 行為測試后兩周, 將動物(每組動物總數 1/3)麻醉, 生理鹽水灌注, 取腦。將腦置于Golgi-Cox溶液中, 置于黑暗,2 d后置換于新Golgi-Cox溶液。浸泡14 d后將腦轉入30%蔗糖溶液中, 室溫中放置3 d。在6%蔗糖溶液中進行震動切片機切片, 厚度100 μm。立刻鋪片, 依次用以下溶液浸染：蒸餾水、15%～30%氨水、酸性顯影固定液、蒸餾水、 梯度酒精和二甲苯。最后以中性樹膠封片, 光學顯微鏡(油鏡×100)下觀察計數。每張腦片至少隨機選取5個皮層錐體神經元, 并根據以下特征選取：1)神經元位于OFC皮層第五層; 2)神經元符合錐體神經元形態, 在10倍物鏡下應表現出整體浸染均勻; 3)每個胞體至少發出3個基樹突; 4)未因染色而造成形變。對符合條件神經元進行照相記錄。在計數統計中, 記錄同級分支樹突單位長度上的樹突棘個數。

1.5.2 免疫組織化學法 全部行為測試完成后, 立刻對動物(每組動物總數1/3)麻醉, 依次用0.1 mol/L PBS和4%多聚甲醛灌注、取腦, 4%多聚甲醛中后固定9 h, 轉入30%蔗糖溶液, 在4℃下, 靜置24 h,冰凍切片(40 μm厚), 按照免疫組化步驟, 依次進行抗體孵育和顯色。

1.5.3 Western blotting 行為測試后, 立刻麻醉動物(每組動物總數 1/3), 取腦, 根據大鼠腦圖譜切出OFC, 每只動物稱取相同重量右側OFC組織, 加入裂解液勻漿, 4℃離心5 min(1.2 萬 r/m)取上清液。加入5×SDS 凝膠上樣緩沖液, 沸水煮5 min, 每孔上樣20 μL(體積根據蛋白含量確定), 進行12%十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳, 采用半干轉膜法將蛋白轉移至 PVDF膜上, TBST 震蕩洗滌3 次, 10 min/次; 后用含10%脫脂奶粉的TBS 封閉2 h; TBST 震蕩洗滌3 次(10 min/次); 室溫下一抗(1∶500)孵育 1 h; TBST 震蕩洗滌 3 次(10 min/次); 二抗封閉 2 h(1∶2 000);TBST 震蕩洗滌4次(10 min/ 次); 采用化學發光法,暗室膠片顯色。

1.6 數據統計與分析

使用 SPSS15.0進行統計分析, 結果以平均值±標準誤表示。采用單因素方差分析和Tukey post hoc檢驗, 以P＜0.05作為判斷差異顯著性的標準;取腦的過程中檢測不銹鋼套管植入位置, 定位不正確者, 相關數據棄去不用。

2 結 果

2.1 行為學結果

2.1.1 強迫游泳測試結果 單因素方差分析顯示不同的處理對強迫游泳中不動時間(F2,28=16.538,P＜0.01)和攀爬時間(F2,28=9.529,P＜0.01)產生了具顯著差異的影響：相對生理鹽水組, 注射GABA顯著增加了攀爬時間(P＜0.01), 而 OFC 注射CGP35348反轉了GABA的這種效應(P＜ 0.05)(圖2B)。不動時間也表現出相類似的結果, GABA顯著減少了不動時間, 而 CGP35348抑制但未反轉GABA對不動時間的減弱效應(圖2A)。

圖2 Saline組、GABA組和CGP組強迫游泳測試中不動時間(A)和攀爬時間(B)Fig. 2 Immobility(A)and the climbing time(B)in different treatment, salineGABA and CGP35348

2.1.2 開場實驗測試結果 單因素方差分析顯示,在水平運動行為、垂直運動、修飾行為和中央格停留時間等 3個參數上, 3組間表現出顯著差異(locomotor:F2,30=14.57,P＜ 0.05; rearing:F2,30=5.58,P＜ 0.01; grooming:F2,30= 13.47,P＜ 0.01;central time:F2,30=5.96,P＜ 0.05)。相對于 Saline 組,GABA 組明顯增加了水平運動行為(P＜ 0.05)(圖3A)、垂直運動(P＜ 0.05) (圖 3B)和修飾行為(P＜ 0.05) (圖3C), 同時，減少了動物在中央格停留的時間(P＜ 0.01) (圖3D), 而注射CGP35348抑制了GABA在水平運動(P＜0.05)(圖3A)和垂直運動行為(P＜ 0.05) (圖 3B)以及中央格停留時間(P＜ 0.05)(圖3D)上的效應, 同時, 反轉了GABA在修飾行為上的效應(P＜ 0.01) (圖 3C)。

圖3 開場實驗中Saline組、GABA組和CGP組的水平運動得分(A)、垂直運動得分(B)、修飾得分(C)和中央格停留時間(D)Fig. 3 Result of different treatment saline, GABA and CGP35348 on(A)loco motor activity, (B)rearing, (C)grooming and(D)central time in open filed test

2.2 樹突棘密度變化

四組間在樹突長度上未表現出顯著差異(one-way ANOVA,F3,40= 5.253,P＞0.05)（表 1）, 但在樹突棘密度上表現顯著差異(one-way ANOVA,F3,40=7.232,P＜0.05)(圖 4A)。生理鹽水組與空白對照組相比, 樹突棘密度顯著減少(P＜0.05)(圖 4B),GABA組相對于生理鹽水組則表現出樹突棘密度增大的趨勢(P＜0.05)(圖 4B), 而 CGP35348組相對于 GABA組樹突棘密度較小(P＜0.05), 但是與生理鹽水組相比較大, 且差異顯著(P＜0.05)(圖 4B), 其減弱了GABA增加樹突棘密度的效應。

表1 四組大鼠眶額葉錐體神經元樹突棘密度Tab. 1 Effect of four treatments on spine density of Pyramidal neurons in OFC

圖4 樹突棘密度統計和顯微照片 (標尺：5 μm)Fig. 4 Result of spine density and the image(Scale bars, 5 μm)

2.3 OFC區Kalirin-7表達的變化

單因素方差分析顯示免疫組化(圖 5a、b、c、d)表現出組間顯著性差異(F3,40=24.572,P＜0.05)。生理鹽水組對應于Control組, 則表現出Kalirin-7表達顯著減少, 而與GABA組相比, GABA則顯著增加了Kalirin-7 的表達, CGP35348則抑制了GABA對于Kalirin-7表達增加的效應。圖5e顯示了OFC免疫印跡的結果, 表現出與免疫組織化學一致的結果。

3 討 論

關于抑郁癥發生機制, 人們已從神經遞質、受體失調等方面提出了許多學說。但越來越多的證據表明, 抑郁癥是一種涉及到多種神經遞質和腦區,以及神經環路的疾病, 并且功能失調也與神經結構的變化密切相關。因此, 本研究通過強迫游泳應激建立抑郁模型, 探討OFC區GABA及其B型受體在應激性抑郁發生中的作用以及應激、GABA及其B型受體、神經元形態結構, 尤其是樹突棘變化與抑郁發生的關系。

3.1 OFC與抑郁樣行為

大量證據表明, OFC可能與應激誘導的情緒失調有密切的聯系。研究發現, OFC損傷可能導致情緒失調中的負反饋反應障礙, 多數抑郁癥患者伴隨有認知和判斷及執行障礙。老年抑郁患者中多數也發現伴隨有OFC退化(Bremner et al, 2002), 如體積縮小、神經元減少等, 尤其在男性患者中表現更多(Lavretsky et al, 2004); 也有證據表明, 局部的OFC損傷可導致聲音、表情等出現異常化的情緒表現(Blair & Cipolotti, 2000; Hornak et al, 2003)。OFC 因與邊緣區的廣泛聯系, 發揮著抽象記憶等信息傳遞的樞紐作用, 是前額葉的主要亞區之一, OFC與基底杏仁核和伏隔核的聯系, 負責對未來預期和價值判斷, 從而引導決策和執行(Schoenbaum et al, 2006;Elliott et al, 2010), 而抑郁癥患者多數具有決策、執行的錯位。在臨床上廣泛應用的抗抑郁藥氟西汀可以恢復成年大鼠因應激而造成的視覺相關皮層的神經損傷。嗎啡也可以增加前額葉由于應激而導致的樹突棘密度減少。因此, OFC與應激性情緒行為的關系應該予以關注。

圖5 免疫組織化學(a, b, c, d)與Western blotting(e)顯示各組眶額葉Kalirin-7的表達Fig. 5 Expression of Kalirin-7 in orbital frontal cortex by immunohistochemisty(a, b, c, d) and western blotting(e)

3.2 OFC區GABA及其B受體與抑郁樣的行為及神經元形態學變化

研究顯示, GABA及其受體廣泛分布于大腦皮層, 在OFC區, GABA能神經元接受來自下丘腦的GABA能神經元發出的投射, 而下丘腦在應激反應中具有重要的作用。也有研究發現, OFC區多巴胺(Dopamine, DA)與獎賞環路的聯系受到諸多重視,如部分藥物成癮可以被 OFC區 DA阻斷劑治療(You et al, 2001), GABA在邊緣系統與DA相互作用,調節下丘腦垂體系統等區域(Racagni & Apud, 1982;Schiffer et al, 2001)。有關GABA受體與情緒行為的研究, 以往較多的關注GABA-A型受體, 并且已成為多種臨床精神疾病藥物的作用靶標; 但GABA-B受體雖然認為與多種精神疾病相關, 而相關報道相對就較少。GABA-B型受體是G蛋白偶聯受體, 通過G蛋白次級信息系統調節Ca2+和K+通道, 在突觸前膜和后膜上的功能不同(Le Corronc et al, 2002),它還可通過降低細胞內cAMP的水平, 影響突觸囊泡的募集, 從而導致多種神經或精神疾病, 這已經得到學界公認。

以上研究結果提示, OFC區 GABA也可能直接或通過DA間接影響獎賞等情緒動機行為, 而抑郁癥的重要表現就是動機的缺失。但是, OFC區GABA及其B受體在應激中的具體作用尚不清楚。抑郁的發生中, OFC區GABA-B受體可能通過對其它神經遞質或者受體的作用影響到神經傳遞, 最終導致神經結構性損傷 (Racagni & Apud, 1982; Wang et al, 1990; Chen et al, 2005)。為了證明應激性抑郁發生中GABA及其B型受體與神經元退行性變化,尤其是神經元樹突棘的變化的關系, 本研究以急性強迫游泳作為應激源, 它是一種廣泛使用的評價抗抑郁藥療效的模型, 對很多抗抑郁藥物敏感。強迫游泳之后, 進行開場實驗和強迫游泳測試以檢測其快感缺失和行為絕望程度, 并檢測 OFC錐體細胞樹突棘變化。實驗結果顯示, 大鼠強迫游泳應激之后, 開場實驗中站立和修飾次數減少, 游泳不動時間增加, 動物表現出明顯的抑郁樣的行為, 且 OFC錐體細胞樹突棘密度也明顯減少。這與以往一些案例研究發現, 抑郁患者 OFC變小并且伴隨著 OFC神經細胞凋亡的現象是一致的。而 OFC微量注射GABA可以反轉應激引起的行為學和神經形態學變化。GABA抗應激性抑郁樣的行為及其OFC錐體細胞樹突棘減少的作用可以被 GABA-B受體阻斷劑所阻斷, 表明OFC區GABA抗抑郁作用通過B型受體實現的, 同時也說明強迫游泳應激引起抑郁與OFC神經元退行性變化有關, 而GABA抗抑郁與維持和保護神經元正常形態有關。

3.3 GABA通過B受體影響樹突棘密度和情緒行為與Kalirin-7有關

研究結果顯示, 強迫游泳應激導致神經元樹突棘減少, GABA通過B型受體增加神經元樹突密度。以往的研究證明, Kalirin 是一種Dbl家族的鳥苷酸交換因子, 它從細胞骨架結構組織到軸突導向以及基因表達影響多種細胞的結構與功能, 而 Kalirin-7尤其在細胞骨架組織上具有重要作用, 存在于多數哺乳動物中, 定位于突觸后致密成分中, 與谷氨酸NMDA受體共存, 與 PSD95交互作用影響樹突棘形態(Hansel et al, 2001; Ma et al, 2003; Sommer &Budreck, 2009)。通過Kalirin敲除小鼠證實, Kalirin在神經元建構方面具有重要作用(Ma et al, 2008)。Kalirin敲除小鼠表現出諸多精神分裂癥狀, 比如運動行為減少, 反應遲鈍, 并且Kalirin的存在是突觸有活性的條件之一, 而樹突棘正是有活性突觸形成的重要位點(Ma et al, 2010)。那么, 強迫游泳應激導致神經元樹突棘減少, GABA抗抑郁與維持和保護神經元正常形態是否與Kalirin-7表達變化有關, 為了證明這一點, 我們檢測了與神經元形態, 尤其是神經元樹突和樹突棘密切相關的 Kalirin-7表達變化。研究發現, 強迫游泳應激引起大鼠抑郁樣的行為, OFC錐體細胞樹突棘減少的同時, OFC區Kalirin-7表達減少。 微量注射GABA, Kalirin-7表達增加, 神經元樹突棘密度也增加, 同時, 也顯著地改善了抑郁樣行為。

綜上所述, 應激誘發抑郁可能與 OFC區Kalirin-7減少和神經元退行性變化有關。OFC微量注射 GABA能產生抗抑郁效應, 其中, OFC區GABA抗抑郁效應經B型受體, 促進Kalirin-7的表達, 維持和保護神經元形態和功能正常是重要途徑之一。

致謝：感謝美國Connecticut大學神經科學系馬新明博士為本研究提供Kalirin-7抗體。

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Rat orbital frontal (orbital frontal cortex, OFC) GABA B receptor mechanisms in stress and depression

GU Chao-Yang, AN Shu-Cheng*

(College of Life Science,Shaanxi Normal University,Xi'an710062,China)

Stress-induced depression is a kind of functional and structural disability of the brain and involves many neurotransmitters and regions of the brain. A number of studies suggest involvement of γ-Aminobutyric acid (GABA) in the orbital frontal cortex (OFC) in the mechanism of stress-associated depression-like behavior in rodents. However, little work has been done on the relationship between GABA and neural plasticity of the OFC under stress. Here we examine the effect of the GABA in the OFC during acute forced swim stress (FSS). We found remarkable depression-like behavior in FSS and an open field test (OFT), and we observed a marked decrease in Kalirin-7 expression and the basal dendritic spine density of layer V pyramidal neurons in OFC after FSS. GABA administration reversed these changes, which were inhibited by CGP35348, an antagonist of GABA-B receptors. These results suggest an anti-depression effect of GABA in the OFC, which may be mediated by GABA-B receptor. The anti-depression effect of GABA is related to the plasticity of the dendritic spine density. This discovery may be helpful in the development of new therapies to treat depression.

Forced swimming; Depression; Stress; Kalirin-7; GABA; Spine

Q42; R749.72

A

0254-5853-(2011)03-0329-08

10.3724/SP.J.1141.2011.03329

2010-08-23；接受日期：2011-01-19

中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(GK200901011)?

Corresponding author)，E-mail: shuchengan@snnu.edu.cn

谷朝陽, 男, 博士研究生, 主要從事神經生理學方面的研究