兩個99Tcm標記胸苷衍生物在小鼠體內分布的比較

陸春雄，蔣泉福，唐 婕，譚 成，張建康

1.江蘇省原子醫學研究所 衛生部核醫學重點實驗室／江蘇省分子核醫學重點實驗室，江蘇 無錫 214063；2.江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122

目前，臨床常用的腫瘤顯像劑是氟（18F）標記的2-脫氧-2-氟葡萄糖（18F-FDG），是葡萄糖的類似物。然而，18F-FDG不是腫瘤的特異顯像劑，因為還有很多其它細胞攝取葡萄糖比正常細胞高，如在炎癥灶處發現的巨噬細胞［1］。另外，由于腦中的葡萄糖代謝很旺盛，所以18FFDG不適合腦部腫瘤的顯像。因此，研究者們不斷研發其它可供選擇的腫瘤顯像劑，如顯示腫瘤增殖的放射性標記的胸苷衍生物：3’-脫氧-3’-氟胸苷［2］（18F-FLT，結構式如圖1所示）。但是，18F需要加速器生產，而且18F標記的分子探針需要在特殊防護的熱室中制備，這使得18F標記的分子探針價格比較昂貴，廣大病人還難以承受。而锝（99Tcm）是SPECT顯像中使用最普遍的放射性核素，由鉬-锝發生器產生，價格低廉，而且有顯像需要的理想核素特性（半衰期6h，能量140keV）［3］。因此，很多研究小組［4-7］對胸苷結構進行各種修飾，希望找到適合腫瘤顯像的锝標記胸苷衍生物。

本工作擬對胸苷嘧啶環的5位和N-3位進行修飾，得到2個新的锝標記胸苷衍生物的前體｛2-巰基乙基-［2-（2-巰基乙基氨基）乙酰基］氨基｝-甲基-2’-脫氧尿苷（簡稱ANMdU）和N3-｛N’-［（2-巰基乙基氨基）乙酰基］-2-氨基乙基巰基-1-己酰胺基｝-胸苷（簡稱NHT）進行標記，得到99Tcm-ANMdU和99Tcm-NHT（結構式如圖1所示）。通過 考 察99Tcm-ANMdU和99Tcm-NHT在 荷 瘤鼠體內的生物分布，評價它們作為腫瘤顯像劑的可能性。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

β-胸苷，純度大于99%，新鄉拓新生化科技有限公司；對甲基苯甲酰氯和6-溴己酰氯，百靈威（J＆K）化學試劑有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。鼠源性肝癌HepA腹水、ICR小鼠，均由江蘇省原子醫學研究所提供。

MALDI SYNAPT Q-TOF MS質譜儀，美國Waters公司；AVANCEⅢ400MHz核磁儀，瑞士Bruker公司；C5002γ-計數器，美國PACKARD-COBRA公司；Yanadimoto熔點儀，日本株式會社，溫度未校正。

1.2 實驗方法

1.2.1 ANMdU的合成 ANMdU的合成及其鑒定等參見文獻［7］的報道。

1.2.2 NHT的合成 合成路線圖示于圖2。

（1）3’，5’-二（對甲基苯甲酰酯基）-胸苷（化合物1）的合成

取8gβ-胸苷和1g 4-二甲氨基吡啶（DMAP）加入到500mL三頸燒瓶中，加入250mL二氯甲烷，在攪拌條件下，滴加10mL對甲基苯甲酰氯，滴畢，加熱至回流，直至反應溶液變澄清，將反應液冷卻至室溫，用水洗滌，有機相干燥濃縮后，用二氯甲烷／乙酸乙酯（體積比為1∶1）重結晶，得13.8g白色晶體。產物產率為87.34%；熔點為202～204℃。

圖1 18F-FLT、99 Tcm-ANMdU和99 Tcm-NHT的結構式Fig.1 Structure of 18F-FLT，99 Tcm-ANMdU and 99 Tcm-NHT

圖2 NHT的合成路線Fig.2 Scheme for synthesis of NHT

（2）N-｛［2-（2-（S-（4-甲氧基芐基）巰基）乙基氨基）乙酰基］-S-（4-甲氧基芐基）-2-氨基乙基巰基｝-6-溴-1-己酰胺（化合物2）的合成

在通氮氣條件下，取2g N-［2-（2-（S-（4-甲氧基苯基）巰基）乙基氨基）乙酰基］-S-（4-甲氧基苯基）-2-氨基乙基硫醇和0.6g DMAP溶于50mL CH2Cl2中，于0℃滴加1g 6-溴己酰氯，滴畢，反應液溫度逐漸升至室溫，繼續攪拌反應4h，分別加水和飽和NaHCO3溶液洗滌，有機層用無水Na2SO4干燥，濃縮過硅膠柱，洗脫劑為CH2Cl2，得2g白色固體。熔點為79～81℃。

（3）N-｛N’-［2-（2-（S-（4-甲氧基芐基）巰基）乙基氨基）乙酰基］-S-（4-甲氧基芐基）-2-氨基乙基巰基-1-己酰胺基｝-3’，5’-二（對甲基苯甲酰酯基）-胸苷（化合物3）的合成

在通氮氣條件下，取0.2g化合物1，0.17g化合物2和2g K2CO3加入到100mL燒瓶中，加入50mL DMF／丙酮（體積比為1∶1）的混合液，于50℃攪拌反應20h，將反應液冷至室溫，過濾，將濾液蒸干后用100mL乙酸乙酯溶解，加水洗滌，有機層用無水Na2SO4干燥，濃縮過硅膠柱，洗脫劑為乙酸乙酯／石油醚（體積比為1∶1），得白色固體0.27g，產率為96.4%。

（4）N-｛N’-［2-（2-（S-（4-甲氧基芐基）巰基）乙基氨基）乙酰基］-S-（4-甲氧基芐基）-2-氨基乙基巰基-1-己酰胺基｝-胸苷（化合物4）的合成

取0.26g化合物3，加入30mL 0.27mol／L的甲醇鈉甲醇溶液，室溫攪拌反應1h，蒸干甲醇，加50mL水和50mL氯仿振蕩，分出有機層，用無水Na2SO4干燥，濃縮過硅膠柱，洗脫劑為氯仿／甲醇（體積比為1∶1），得白色泡沫狀固體0.16g，產率為86.0%。

（5）N-｛N’-［（2-巰基乙基氨基）乙酰基］-2-氨基乙基巰基-1-己酰胺基｝-胸苷（化合物5，NHT）的合成

在冰水浴條件下，將0.15g化合物4溶于5mL三氟乙酸中，加入0.17g醋酸汞和0.26mL苯甲醚，反應液呈棕色，將反應液逐漸升至室溫，在室溫繼續攪拌30min，抽干溶劑，得深紫色油狀物，真空干燥30min，加入15mL干燥乙醚，攪拌10min，傾去乙醚，真空干燥30min，用15mL乙醇溶解干燥物，通硫化氫氣體20min后，4 000r／min離心5min取出上清液濃縮，得淡黃色油狀物0.09g，即標記前體NHT，產率為68.7%。

1.2.399Tcm-ANMdU和99Tcm-NHT的制備 取30μg標記前體（ANMdU或者NHT），溶于30μL乙醇中，加入80μL 10g／L葡庚糖酸鈉溶液、80μL 10g／L乙二胺四乙酸溶液、15μL 5g／L氯化亞錫溶液，再加入1mL（74MBq）高锝酸鈉淋洗液（Na99TcmO4），密閉，搖勻后于100℃加熱30min，冷卻后點樣，以聚酰胺薄膜為載體，甲苯／乙腈／甲醇（體積比為3∶1∶1）為展開劑。

1.2.499Tcm-NHT的穩定性研究 將制備得到的99Tcm-NHT通 過0.22μm的 無菌濾膜制成99Tcm-NHT注射液，分別于0、1、2、3、4、5、6h測定放射化學純度。

1.2.5 肝癌HepA荷瘤鼠的制備 抽取保種小鼠體內的肝癌HepA腹水，用生理鹽水稀釋4倍。取0.2mL腹水溶液（約2×106個腫瘤細胞）經皮下注射，接種于小鼠的右前肢腋下，正常飼養一周左右，腫瘤直徑大約0.8cm，備下一步實驗。

1.2.699Tcm-NHT正常小鼠體內分布 取ICR小鼠25只，分為5組，每組5只，經尾靜脈注射0.2mL（3.7×106Bq）99Tcm-NHT，分別于注射后5、30、60、120、180min斷頭處死。解剖取出腦、腫瘤、心、肝、脾和肺等臟器，稱重后測量放射性計數，計算每克組織百分注射劑量率。

1.2.799Tcm-ANMdU和99Tcm-NHT在 肝 癌HepA荷瘤鼠體內分布 取荷瘤鼠25只，分為5組，每組5只，經尾靜脈注射0.2mL（3.7×106Bq）99Tcm-ANMdU（或99Tcm-NHT），分別于注射后5、30、60、120、180min斷頭處死。解剖取出腦、腫瘤、心、肝、脾和肺等臟器，稱重后測量放射性計數，計算每克組織百分注射劑量率。

2 結果和討論

2.1 NHT的合成

以β-胸苷為起始原料，經多步反應合成得到標記前體NHT，反應的總收率為34.68%。

化合物1的MS（m／z）：479（M＋H），501（M＋Na）。1H NMR（CDCl3，δ）：8.22（s，1H），7.93（t，4H），7.29（t，4H），7.26（s，1H），6.43～6.48（q，1H），5.64（d，1H），4.64～4.81（dd，2H），4.52（q，1H），2.70（m，1H），2.43（d，6H），2.28～2.33（m，1H），1.62（s，3H）。

化合物2的MS（m／z）：611，613（M＋H），633，635（M＋Na）。1H NMR（CDCl3，δ）：8.25（s，1H），7.25（m，4H），6.85（m，4H），4.01（s，1H），3.89（s，1H），3.76（s，6H），3.70（s，2H），3.68（m，2H），3.40～3.48（m，4H），3.30（s，2H），2.50～2.61（m，4H），2.28～2.38（m，2H），1.82（m，2H），1.60（m，2H，），1.45（m，2H）。

化合物3的MS（m／z）：1 009（M＋H）。1H NMR（CDCl3，δ）：8.23（s，1H），7.93（q，4H），7.22～7.23（m，8H），7.20（s，1H），6.83（m，4H），6.49（m，1H），5.62（d，1H），4.64～4.78（dd，2H），4.51（d，1H），3.89（s，2H），3.86（s，2H），3.78（s，6H），3.66（d，4H），3.32～3.42（m，4H），2.69（dd，2H），2.49～2.60（m，4H），2.42（d，6H），2.22～2.32（m，2H），1.64（s，3H），1.56（m，4H），1.33～1.37（m，2H）。

化合物4的MS（m／z）：773（M＋1），795（M＋Na）。1H NMR（CDCl3，δ）：8.32（s，1H），7.33（s，1H），7.22（m，4H），6.83（m，4H），6.65（t，1H），6.16（m，1H），4.58（m，1H），3.98（dd，2H），3.93（m，2H），3.89（m，2H），3.78（s，6H），3.65～3.68（m，4H），3.32～3.42（m，4H），2.49～2.62（m，4H），2.42（m，2H），2.25～2.32（m，2H），2.22（m，1H），2.05（s，1H），1.91（s，3H），1.65（m，4H），1.35（m，2H）。

化合物5的MS（m／z）：533（M＋1），555（M＋Na）。1H NMR（CD3OD，δ）：8.25（s，1H），7.82（m，1H），6.31（t，1H），4.37～4.42（m，1H），4.16（s，1H），3.97（dd，2H），3.92（m，2H），3.73～3.80（m，2H），3.61（m，2H），3.5（m，1H），3.33～3.43（m，4H），3.22（m，1H），2.59～2.73（m，4H），2.42～2.53（m，2H），2.16～2.33（m，2H），1.91（s，3H），1.58～1.74（m，4H），1.35～1.42（m，2H）。

2.2 99Tc m-ANMdU和99Tc m-NHT的制備

99Tcm-ANMdU和99Tcm-NHT的 標記率均大于95%，锝膠體的Rf值 為0～0.1，99Tcm-ANMdU的Rf值為0.6～0.7，99Tcm-NHT的Rf值為0.5～0.6。

2.3 99Tc m-NHT的穩定性

結果表明，99Tcm-NHT 6h內穩定，放射化學純度仍然大于93%。

2.4 99Tc m-ANMdU肝癌HepA荷瘤鼠體內分布

如表1所示，99Tcm-ANMdU在腎臟中的放射性攝取最高，膀胱次之，說明其主要是經腎臟代謝，且99Tcm-ANMdU在體內的清除很快，肝、腎、膀胱和血的5min時的放射性攝取與60min時放射性攝取的比值分別為4.22、3.13、4.21和12.06，這與99Tcm-ANMdU在 正常小鼠體內分布相一致［7］。99Tcm-ANMdU注 射60min后，荷瘤鼠體內腫瘤的放射性攝取與肌肉、骨和血的放射性攝取的比值達到較高值，分別為1.58±0.17、1.95±0.31和1.17±0.08。

表1 99 Tcm-ANMdU在荷瘤（HepA）小鼠體內分布Table 1 Biodistribution of 99 Tcm-ANMdU in tumor-bearing（HepA）mice

2.5 99 Tc m-NHT在正常小鼠和肝癌HepA荷瘤鼠體內分布

99Tcm-NHT在正常小鼠和肝癌HepA荷瘤鼠體內分布結果列入表2、表3。由表2、3可知：99Tcm-NHT在正常小鼠和荷瘤鼠體內肝臟和腎臟中的放射性攝取最高，說明其主要經肝臟和腎臟代謝；99Tcm-NHT在體內的清除相對較慢，在荷瘤鼠體內，肝、腎、膀胱和血的5min時的放射性攝取與60min時放射性攝取的比值分別為1.55、1.28、1.83和2.02，低 于99Tcm-ANMdU在體內的清除速度（4.22、3.13、4.21和12.06），但與18F-FLT在小鼠體內的清除速度接近［8］。值得注意的是，99Tcm-NHT在 脾 臟 中 的放射性攝取較高，且在60min時達到最大，這是因為脾臟中細胞增殖比較旺盛，與18F-FLT在脾臟中的放射性攝取增加相一致［8］。99Tcm-NHT注射120min后，荷瘤鼠體內腫瘤的放射性攝取與肌肉、骨和血的放射性攝取的比值達到較高值，分別為4.41±0.32、2.45±0.24和1.51±0.18，高于18F-FLT注射60min后腫瘤與肌肉、骨和血的放射性攝取比值［9］1.53、0.47、1.48。

2.6 討論

人們在不斷探索99Tcm標記胸苷衍生物作為腫瘤顯像劑的潛力，較早的是2004年Zhang等［6］對2’-脫氧-2’-氟代尿苷的5位進行修飾，通過戊烯基與N2S2配基連接，與99Tcm的標記率為42%，放射化學純度為98%。2007年有多篇文獻報道有關99Tcm標記胸苷衍生物的研究，如Teng等［4］對胸苷的3’位進行修飾，通過肼基煙酰胺（HYNIC）和其他配基一起進行99Tcm標記，放射化學純度大于97%。這兩篇文獻都只報道合成和標記方面，而沒有生物學的評價和顯像。Celen等［3］對胸苷的N-3位進行修飾，通過丙基連接N2S2配基，認為由于99Tcm標記的基團太大，導致99Tcm標記胸苷衍生物對胸苷激酶（TK）的親和性降低，顯像結果不佳；然而，Desbouis等［5］研究發現，5’位進行修飾通過長鏈連接99Tcm的胸苷衍生物與TK有很好的親和性。這說明可能胸苷母體結構與99Tcm標記基團之間的距離比99Tcm標記基團尺寸大小，對胸苷衍生物和TK親和性的影響更大。

表2 99 Tcm-NHT在正常小鼠體內分布Table 2 Biodistribution of 99 Tcm-NHT in normal mice

表3 99 Tcm-NHT在荷瘤（HepA）小鼠體內分布Table 3 Biodistribution of 99 Tcm-NHT in tumor-bearing（HepA）mice

本工作的ANMdU是胸苷母體結構在5位通過1個亞甲基與N2S2配基相連，胸苷母體結構與99Tcm標記基團之間的距離很近；NHT是胸苷母體結構在N-3位通過1個六碳鏈與N2S2配基相連，胸苷母體結構與99Tcm標記基團之間的距離比ANMdU的大，而且99Tcm-NHT在腫瘤的放射性攝取與肌肉、骨和血的放射性的比值高于99Tcm-ANMdU相應的比值。這說明隨著胸苷母體結構與99Tcm標記基團之間距離的增大，可能可以增加胸苷衍生物對TK的親和性。

3 結 論

99Tcm-ANMdU在荷瘤鼠體內主要經腎臟代謝，且在體內清除迅速，但在腫瘤和血的放射性比值不高；99Tcm-NHT在小鼠體內清除比99Tcm-ANMdU緩慢，但120min時腫瘤中的放射性攝取較高，腫瘤和肌肉、骨及血的放射性比值分別為4.41±0.32、2.45±0.24和1.51±0.18，99Tcm-NHT可能是潛在的SPECT腫瘤顯像劑，值得進一步研究。

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