纖維素酶生產(chǎn)菌的篩選鑒定及其產(chǎn)酶影響因素研究

李毅然，馬 亢

(商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南商丘476000)

纖維素酶生產(chǎn)菌的篩選鑒定及其產(chǎn)酶影響因素研究

李毅然，馬 亢

(商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南商丘476000)

通過篩選從土壤和腐朽樹木中得到了4株纖維素酶高產(chǎn)菌株MF1、MF4、TF3和TF9，經(jīng)初步鑒定分別是綠色木霉、擴展青霉、康氏木霉和黑曲霉.通過對TF3發(fā)酵產(chǎn)酶的影響因素研究表明，其發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳碳源是麩皮－纖維素粉復(fù)合物，最佳氮源是硫酸銨，最適發(fā)酵溫度范圍是30～32℃，最適宜初始pH范圍是6～7.

篩選;鑒定;纖維素酶;影響因素

纖維素酶是指能夠?qū)w維素類物質(zhì)進(jìn)行降解并生成葡萄糖的一類酶的總稱，是幾種具有不同酶活力的酶復(fù)合物，主要包括外切纖維素酶、內(nèi)切纖維素酶、β－葡萄糖苷酶等［1］.利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶將纖維素轉(zhuǎn)化為食品、能源和化工材料，對解決人類所面臨的諸多問題具有極大的現(xiàn)實意義.因此，篩選具有高活性纖維素酶的微生物菌株是該領(lǐng)域的研究熱點和難點之一.本實驗分離到了4株纖維素酶活性較高的菌株，并對其產(chǎn)酶溫度和初始pH條件做了研究.

1 實驗材料

1.1樣品采集

樣品采自于商丘市伐木場鋸末堆下土壤、森林公園腐朽樹木，將樣品置于實驗室進(jìn)行自然風(fēng)干，除去雜質(zhì)，粉碎，過篩，然后裝入樣品袋待用.所用試劑藥品均為市售分析純.

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基:(NH4)2SO41g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl20.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5mg，CMCNa 5g，葡萄糖2.5g，蛋白質(zhì)1g，蒸餾水1000ml.

篩選培養(yǎng)基:CMCNa 5g，KCl 0.5g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.25g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5mg，NaNO33g，剛果紅0.05g，蛋白胨 1g，瓊脂粉 15g，蒸餾水 1000ml.

種子培養(yǎng)基:纖維素粉(MCC)25g/L，麩皮 20g/L，(NH4)2SO41.5g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH自然.

發(fā)酵培養(yǎng)基:CMC 7g/L，麩皮 6g/L，(NH4)2SO42g/L，蛋白胨 0.6g/L，吐溫 － 80 1.5mL/L，KH2PO42g/L，CaCl20.3g/L，MgSO4 0.3g/L，Mn SO4·4H2O 0.3g/L，pH6.

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:CMCNa 20g，KH2PO42g，(NH4)2SO42.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl2·2H2O 0.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5mg，MnSO4·4H2O 1.5mg，ZnSO4·7H2O 2mg，CoCl2·6H2O 1.7mg，吐溫 －80 1.5ml，蒸餾水 1000ml，pH 自然.

PDA 培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，蔗糖20g，水1000ml.

1.3 溶液配制

檸檬酸緩沖液:稱取7.16g Na2HPO4，溶于蒸餾水中，定容至100ml，即為0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液;稱取2.1g檸檬酸，溶于蒸餾水中，定容至100ml，即為0.1mol/L檸檬酸溶液.取0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液24.3ml和檸檬酸溶液25.7ml混勻.

羧甲基纖維素鈉溶液:準(zhǔn)確稱取羧甲基纖維素鈉2.0g，溶于200ml蒸餾水中，沸水浴中加熱至融化，過濾，取濾液150ml，加檸檬酸緩沖液 30ml，蒸餾水 60ml，混勻，置于冰箱中備用.

3，5－二硝基水楊酸顯色液［2］:按照文獻(xiàn)［2］中提供的方法配制，貯存于棕色瓶中放置于冰箱中備用.

標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液:稱取已烘干的葡萄糖200mg，溶于蒸餾水中，定容至200ml.

2 實驗方法

2.1 菌種分離篩選

取處理好的樣品10g放入裝有100mL無菌水和無菌玻璃珠的三角瓶中，振蕩10min后吸取上清液，將上清液接入富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng);取富集培養(yǎng)液，按梯度稀釋到10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，分別涂布到篩選平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3～6d，挑取具有明顯水解圈的菌落進(jìn)行純化，并將純化后的菌株用斜面保存于4℃冰箱中;將保存的純化菌株制備成種子培養(yǎng)液，按照10%接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)各菌株酶活性高低進(jìn)行復(fù)篩，并將復(fù)篩得到的菌株進(jìn)行保存.

菌株鑒定:將篩選出的菌株用平板進(jìn)行純培養(yǎng)，根據(jù)其菌落、菌絲、孢子形態(tài)及其生長特性，依據(jù)《真菌鑒定手冊》、《中國真菌志》和《微生物學(xué)教程》等進(jìn)行分類鑒定.

2.2 CMCase和FPAase酶活測定

CMCase和 FPAase 酶活測定參考趙玉萍［3］，高培基［4］和張瑞萍［5］所提供的方法，酶活單位采用國際單位制.

2.3 菌株產(chǎn)纖維素酶的影響因素研究

(1)不同碳、氮源培養(yǎng)基對產(chǎn)酶的影響.實驗分別以稻草粉、麩皮、纖維素粉3種物質(zhì)及其復(fù)合物為碳源替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的CMCNa，不同碳源添加量均為20g/L，分別將不同碳源培養(yǎng)基裝入250mL錐形瓶中，按照5%接種比例接入菌種子液，在28℃下，160r/min震蕩培養(yǎng)120h，然后測定不同碳源的產(chǎn)酶量.在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加2.5g/L的硫酸銨、氯化銨、碳酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、牛肉膏、黃豆餅粉為氮源，其他物質(zhì)元素不變，培養(yǎng)條件同上.培養(yǎng)后測定不同氮源的產(chǎn)酶量.

(2)溫度對產(chǎn)酶的影響.發(fā)酵液培養(yǎng)基成份和其他培養(yǎng)條件同 2.3(1)，分別在 25、28、30、32、35、38℃下發(fā)酵培養(yǎng)120h，測定不同培養(yǎng)溫度的產(chǎn)酶量.

(3)初始pH對產(chǎn)酶的影響.發(fā)酵液培養(yǎng)基成份和其他培養(yǎng)條件同2.3(1)，分別將培養(yǎng)基初始 pH 調(diào)至3、4、5、6、7、8，振蕩培養(yǎng)120h，測定不同初始pH的產(chǎn)酶量.

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 篩選菌株的纖維素酶產(chǎn)量

將初篩得到的9株真菌，按5%接種比例接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，依據(jù)2.3(1)中的培養(yǎng)條件，震蕩發(fā)酵培養(yǎng)120h后，測定各菌發(fā)酵液產(chǎn)酶量，得到產(chǎn)酶量較高的菌株有4株，它們的產(chǎn)酶活性測定結(jié)果如表1所示.從表1可以看出，復(fù)篩得到的4株菌，其中 CMCase活性較高的是 TF3，達(dá)到241.3IU/mL，F(xiàn)PAase 活性較高的是 TF9，達(dá)到 7.8IU/mL.

表1 菌株發(fā)酵液的纖維素酶活力

3.2 目的菌種形態(tài)學(xué)分析和鑒定

通過富集培養(yǎng)和平板篩選，分別從伐木場鋸末堆土壤和森林公園腐朽樹木中，初步篩選出9株具有較大透明圈的真菌.分別是 MF1、MF4、TF3、TF9，其中 MF1、MF4 源于腐朽樹木，TF3、TF9源于鋸末堆土.在PDA平板上培養(yǎng)并觀察各菌落生長特征.其中MF1菌落初步形成白色絨毛狀，圓形，致密，隨著培養(yǎng)時間延長中部變?yōu)榫G色，而后成為深綠色，隨生長期進(jìn)一步延長，菌落出現(xiàn)輪狀濃密的菌絲并產(chǎn)生大量孢子.菌落背面現(xiàn)灰色.孢子梗分枝少，呈次級單分枝并有彎曲.分生孢子較大呈球狀.通過比對，與綠色木霉的生長特征最相似，初步鑒定為木霉屬，綠色木霉.MF4菌落初期呈現(xiàn)白色絮狀，而后變成灰綠色，菌落逐漸變厚，表面呈毛毯狀，外圈白色毛狀并向四周延伸.通過鏡檢，菌絲為白色有隔，分生孢子梗呈扇形輻射狀.初步鑒定為青霉屬.TF3菌落生長初期為白色絨毛狀，呈圓形，致密，而后菌落中部變成綠色，菌落出現(xiàn)輪狀有白色菌絲，最后菌落變成黃綠色，菌落背面現(xiàn)微黃色.孢子梗束狀，有三級分枝，分生孢子呈橢圓狀.初步鑒定為木霉屬，康氏木霉.TF9菌落生長初為白色，而后呈黑褐色厚絨毛狀，背面略呈黃色.分生孢子梗叢生，長短不同，分生孢子球狀，黑褐色.初步鑒定為黑曲霉.

3.3 菌株TF3的發(fā)酵產(chǎn)酶影響因素分析

為進(jìn)一步考察分離菌株的產(chǎn)酶能力，實驗以TF3為研究對象，對菌株的主要發(fā)酵條件進(jìn)行了研究分析.

(1)碳源、氮源對纖維素酶活性的影響.不同碳源對TF3產(chǎn)酶的影響實驗結(jié)果見表2，從實驗結(jié)果看，不同碳源對產(chǎn)酶具有較明顯的影響.當(dāng)發(fā)酵液加麩皮和纖維素處理后，菌株的產(chǎn)酶活性量最高，CMCase和 FPAase的活性分別達(dá)到278.1IU/mL和8.9IU/mL.因此，TF3 菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的合適碳源為麩皮和纖維素粉的復(fù)合物.當(dāng)僅用稻草粉處理時，纖維素酶活性最低，其中CMCase和CMCase的活性只有117.2IU/mL和4.1IU/mL.可見，麩皮纖維素粉復(fù)合物與稻草粉之間差異最為顯著.添加稻草粉的 CMCase活性和CMCase活性平均值分別是 160.1IU/mL和 5.5IU/mL，添加麩皮的CMCase活性和CMCase活性平均值分別是215.8IU/mL和7.4IU/mL，添加纖維素粉的 CMCase 活性和CMCase活性平均值分別是236.6IU/mL和6.8IU/mL.從以上數(shù)據(jù)看，發(fā)酵液中添加纖維素粉有利于CMCase量的提高，添加麩皮有利于FPAase量的提高.

表2 不同碳源對TF3產(chǎn)酶的影響

不同氮源對TF3產(chǎn)酶的影響實驗結(jié)果見表3，從實驗結(jié)果看，不同氮源對產(chǎn)酶也具有較大影響.從產(chǎn)酶活性大小可以得出，硫酸銨提供氮源時，產(chǎn)酶活性最高，黃豆餅粉作為氮源時，產(chǎn)酶活性最低，可見發(fā)酵產(chǎn)酶的最適氮源為硫酸銨，其次是氯化銨.總之，銨態(tài)氮產(chǎn)酶效果好于硝態(tài)氮，無機氮產(chǎn)酶效果好于有機氮.

表3 不同氮源對TF3產(chǎn)酶的影響

(2)溫度對產(chǎn)酶的影響.實驗測定了TF3在設(shè)定的梯度溫度下的產(chǎn)酶能力，實驗結(jié)果見圖1.從圖1可以看出，溫度對TF3產(chǎn)酶能力有明顯影響，當(dāng)發(fā)酵溫度為32℃時，CMCase活性最高達(dá)到261.7IU/mL;當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時，F(xiàn)PAase活性最高，達(dá)到7.3IU/mL.當(dāng)發(fā)酵溫度過低或過高時，CMCase和FPAase活性都顯著降低.可見，TF3發(fā)酵產(chǎn)酶的適宜溫度在30～32℃.

圖1 發(fā)酵溫度對產(chǎn)纖維素酶的影響

(3)初始pH對產(chǎn)酶的影響.實驗測定了TF3在不同初始pH發(fā)酵產(chǎn)酶能力，實驗結(jié)果見圖2.從圖2可以看出，發(fā)酵液初始pH對產(chǎn)酶量具有明顯影響，當(dāng)發(fā)酵液初始pH為6時，CMCase活性最高，達(dá)到248.3IU/mL;當(dāng)發(fā)酵液初始 pH為7時，F(xiàn)PAase酶活達(dá)到最高值7.5IU/mL.可見，TF3發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最適初始pH為6～7.

圖2 初始pH對產(chǎn)纖維素酶的影響

4 結(jié)論

實驗僅從溫度和初始pH兩個方面研究了它們對TF3產(chǎn)酶的影響，要進(jìn)一步檢驗該株菌的產(chǎn)酶潛力大小，還需要對更多的因素及其各因素之間的相互作用進(jìn)行研究.本實驗成功篩選出了4株菌，為后續(xù)的應(yīng)用研究奠定了良好的基礎(chǔ).

［1］羅貴民，曹淑桂，張今.酶工程［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002:371－372.

［2］李安市，等.纖維素分解細(xì)菌的分離和鑒定［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(9):3956 －3959.

［3］趙玉萍，楊娟.四種纖維素酶酶活測定方法的比較［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27(3):116 －118.

［4］高培基.纖維素酶濾紙酶活測定方法的改進(jìn)［J］.植物學(xué)理學(xué)通訊，1986，14(2):46 －48.

［5］張瑞萍.纖維素酶的濾紙酶活和CMC酶活的測定［J］.印染助劑，2002，3(10):51－53.

TQ93

A

1008－7974(2011)10－0046－03

2011－05－20

李毅然(1980－)，男，河南商丘人，碩士，商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院教師.

(責(zé)任編輯:陳衍峰)