滇丹參中丹酚酸B提取及純化工藝研究

　　摘 要：目的：優選滇丹參提取及絮凝沉降法純化丹酚酸B的最佳工藝。方法：以滇丹參主要成分丹酚酸B含量為評價指標，采用正交試驗優選提取及純化的最佳條件。結果：滇丹參的最佳提取條件為8倍量水，煎煮2次，每次1 h；采用ZTC11+1為絮凝沉降劑，藥液濃度在1 g/5 mL，絮凝劑的用量是B∶A=4∶2，攪拌速度為100 r/min時，得到的精制液中丹酚酸B含量最高。結論：使用絮凝澄清的方法精制水提液，用量少，污染小，丹酚酸B的含量損失較少。
　　關鍵詞：滇丹參；丹酚酸B；ZTC1+1型絮凝劑
　　中圖分類號：R284.3文獻標識碼：A
　　文章編號：1007-2349（2011）05-0061-02
　　
　　滇丹參為唇形科鼠尾草屬植物云南鼠尾草（salvia yunnanensis C.H.Wright）的干燥根及根莖，味微苦，性微寒。具有調經、活血、散瘀、鎮靜止痛之功，用于月經不調、風濕痹痛、子宮出血、吐血等癥^［1］。現代藥理作用研究表明，滇丹參具有增加冠狀動脈血流量，防止血栓形成，抑制血小板聚集，降低血黏度，消除自由基，改善血管內皮功能，抑制血管損傷后的內膜增生等功能，在防治冠心病及防治血管成形術后血管再狹窄中均有重要作用^［2］。滇丹參主要含有脂溶性的丹參酮及水溶性的酚酸類成分，水溶性成分中丹酚酸B的含量較高，為3分子丹酚素與1分子咖啡酸縮合而成。丹酚酸B活性強，具有強烈的清除自由基和抗氧化作用。本文以丹酚酸B的含量為評價指標，對滇丹參的提取工藝及絮凝澄清純化工藝進行研究。
　　1 儀器與試藥
　　1.1 儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀（美國）；FB124型電子分析天平（上海舜字恒平科學儀器有限公司）；SK250HP型超聲提取器（上海科學儀器有限公司）。
　　1.2 試藥 丹酚酸B對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111562-200302）；滇丹參（購于云南綠生藥業有限公司）；ZTC1+1天然澄清劑（購于天津正天成澄清技術有限公司）；乙腈、甲醇為色譜純；水為去離子水；其它試劑均為分析純。
　　2 方法與結果
　　2.1 丹酚酸B含量測定
　　2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對照品適量，加75%甲醇制成每1 mL含0.192 mg的溶液，即得。色譜條件：Agilent-C18色譜柱（Φ4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇-乙腈-甲酸-水體積比（26∶9∶1∶64）為流動相；柱溫：35 ℃；檢測波長：286 nm；流速：0.8 mL/min；理論塔板數按丹酚酸B計不低于2000。
　　2.1.2 線性關系的考察 分別精密吸取丹酚酸B對照品溶液4、6、8、10、12、14μL，在上述色譜條件下依次進樣測定。以峰面積積分值為縱坐標，對照品的進樣量為橫坐標進行線性回歸，得到回歸方程為Y=895054x-68669，相關系數r=0.9999。結果表明丹酚酸B進樣量在0.768～2.688 μg范圍內與峰面積呈現良好線性關系。
　　2.1.3 樣品測定 精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μL進樣，以外標法計算含量。
　　2.2 提取工藝研究
　　2.2.1 提取溶劑的選擇 分別稱取40 g（準確到0.01 g）藥材4份，分別以水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇為溶劑，加入8倍量溶劑提取1.5 h，過濾，濾渣再用6倍量溶劑提取1 h，合并濾液，濃縮并定容到500 mL，用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，精密吸取10 μL溶液，注入液相色譜儀，測定丹酚酸B的含量，結果分別為2.18%、2.45%、2.37%、2.09%。表明30%乙醇提取含量最高，但以水為溶劑時，與30%乙醇提取率相差不大，因考慮實際生產的需要，故以水為提取溶劑。
　　2.2.2 水提工藝正交實驗設計
　　2.2.2.1 設計方案 以加水量、提取時間、提取次數為考察因素，以丹酚酸B含量為評價指標，每個因素選取3個水平，采用正交表L9（34）安排試驗，因素水平表見表1。
　　2.2.2.2 實驗方法 稱取藥材9份，每份20 g，按照正交實驗表進行試驗，濾液濃縮并定容到500 mL，用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，精密吸取溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定。
　　2.2.2.3 實驗結果 結果見表2。根據直觀分析結果表明，紫丹參的最佳水提工藝為8倍量水，提取3次，每次1 h，即AB1C3 。由于提取3次和2次的結果相差不大，為了節約成本，將工藝定為8倍量水，提取2次，每次1 h，即AB1C。
　　2.3 絮凝澄清純化工藝研究
　　2.3.1 ZTC1+1澄清劑溶液的配制 ①A組分溶液的配制 稱取ZTC1+1Ⅲ澄清劑A組分1 g，先用少量蒸餾水攪成糊狀，然后加蒸餾水至100mL，溶脹24 h，攪勻，雙層紗布濾過，即得1 %A 組分黏膠液；②B組分溶液的配制 稱取ZTC1+1Ⅲ澄清劑B組分1 g，用少量1 %醋酸溶液溶解并攪成糊狀，然后加1 %醋酸至100 mL，溶脹24 h，攪勻，雙層紗布濾過，即得1 %B 組分黏膠液。
　　2.3.2 設計方案 經過預實驗，發現丹酚酸B在60 ℃時絮凝效果較好，故以60 ℃為絮凝溫度，采用正交試驗對絮凝澄清工藝的主要工藝參數進行優化。選擇藥液濃度、ZTC1+1絮凝劑加入量、攪拌速度3個主要影響因素進行考察，以丹酚酸B含量作為評價指標，用L9（34）正交表安排試驗方案，因素水平設計見表3。
　　2.3.3 實驗方法 按上述最佳提取工藝提取藥材，按正交試驗設計濃縮至不同濃度，分別量取9份濃縮藥液，每份50 mL，在60℃時，加入4 mL的1%B組分溶液用相應的旋轉速度攪拌15 min，保溫1 h，攪拌3 min，然后每隔30 min左右攪拌3 min；1 h后，于60 ℃溫度恒溫攪拌下，分別加入1%A組分黏膠液攪拌3 min，保溫15 min，離心過濾，精密量取1 mL定容至100 mL，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，測定丹酚酸B含量。
　　2.3.4 實驗結果 結果見表4~表5。由直觀分析可知，影響絮凝澄清的因素順序為：藥液濃縮比>絮凝劑組分比>攪拌速度，最佳工藝組合為A1B1C。方差分析顯示，藥液濃度對精制工藝具有顯著性影響。
　　2.3.5 驗證試驗 平行取相同量的藥液3份，每份50 mL。按上述確定的最佳工藝條件進行驗證。同時測得丹酚酸B含量分別為35.62、35.85、35.77 mg/g，驗證結果與正交試驗相符。
　　3 討論
　　由于丹酚酸B在水提液中不穩定，提取時間長及溫度過高均會導致丹酚酸B的含量下降，因此，在實驗過程中需注意丹酚酸B的降解問題。
　　純化工藝研究結果表明，藥液濃縮比為1：5（g/mL）時，丹酚酸B保留率最高，且隨藥液越稀，丹酚酸B的含量越低。絮凝劑組分比隨著A組分的增加，丹酚酸B的含量隨之降低，所以較佳的絮凝劑組分比例在4/2（B/A）時，效果最好。
　　ZTC1+ 1Ⅲ型絮凝澄清劑選擇性地與溶液中的膠質、蛋白質、鞣質絡合而共沉，具有安全無毒、使用簡便、不影響有效成分等特點，相對于水提醇沉工藝使用乙醇而言具有提高目標含量，減少生產周期，減少成本，且制備的干膏吸濕性低等優點。
　　
　　參考文獻：
　　［1］錢子剛.滇丹參藥用植物源［J］.中藥材，2002，25（9）：628.
　　［2］羅慶祎.滇丹參對冠心病的防治作用［J］.臨床誤診誤治，2007，20（5）：23.
　　（收稿日期：2011-02-21）