云南蘿芙木中三種生物堿含量的HPLC法測定

摘要：運用高效液相色譜法（ＨＰＬＣ）測定云南蘿芙木中育亨賓、阿嗎堿、利血平３種生物堿的含量。采用島津ＶＰ－ＯＤＳ Ｃ１８色譜柱（４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，５ μｍ），流動相為甲醇－（０．００４ ｍｏｌ／Ｌ二乙胺）水系統，梯度洗脫，流速為１ ｍＬ／ｍｉｎ，檢測波長 ２７８ ｎｍ，柱溫３０ ℃。結果表明，育亨賓在０．１４0～０．７00 μｇ（ｒ＝０．９９９ １）、阿嗎堿在０．０９６～０．４８0 μｇ（ｒ＝０．９９８ 7）、利血平在０．１０４～０．５２０ μｇ（ｒ＝０．９９８ ８）范圍內呈現良好的線性關系，平均加樣回收率分別為９６．４％、９５．５％、９６．３％，變異系數分別為１．１５％、０．４８％、１．１４％。該方法可同時檢測蘿芙木根中育亨賓、阿嗎堿、利血平3種生物堿，準確，快速，簡便。

關鍵詞：云南蘿芙木；高效液相色譜；育亨賓；阿嗎堿；利血平

中圖分類號：Ｏ６５７．７＋２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）11－2331-03

Determination of Yohimbine，Ajmalicine and Reserpine in Rauvolfia yunnanensis

Tsiang by HPLC

ＤＥＮＧ Ｍｉｎｇ，ＣＡＯ Ｆｕ－ｘｉａｎｇ，ＬＯＮＧ Ｊｉａｎｇ－ｘｕｅ，ＤＯＮＧ Ｘｕ－ｊｉｅ，ＦＡＮ Ｈａｉ－ｙａｎ

（College of Life Science and Technology，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０００４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ（ＨＰＬＣ） ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｏｈｉｍｂｉｎｅ ，ａｊｍａｌｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ ｉｎ Ｒａｕｖｏｌｆｉａ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｔｓｉａｎｇ． Ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｏｎ ａ Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＶＰ－ＯＤＳ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ ２７８ｎｍ．Ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅｓ ｗｅｒｅ ｍｅｔｈａｎｏｌ－０．００４ｍｏｌ／Ｌ １，２－ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｆｏｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ａｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ３０℃．Ｔｈｅｙ ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｆｏｒ ｙｏｈｉｍｂｉｎｅ， ａｊｍａｌｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅｓ ｏｆ ０．１４0～０．７00 μｇ（ｒ＝０，９９９ １）， ０．０９６～０．４８0 μｇ（ｒ＝０．９９８ ７）， ０．１０４～０．５２0 μｇ（ｒ＝０．９９８ ８） ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｗｅｒｅ ９６．４％， ９５．５％， ９６．３％ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ １．１５％，０．４８％，１．１４％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｏｈｉｍｂｉｎｅ， ａｊｍａｌｉｃｉｎｅ，ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ ｉｎ Ｒａｕｖｏｌｆｉａ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｔｓｉａｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ａｃｃｕｒａcy， speediness ａｎｄ conveniency．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｒａｕｖｏｌｆｉａ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｔｓｉａｎｇ； ＨＰＬＣ； ｙｏｈｉｍｂｉｎｅ； ａｊｍａｌｉｃｉｎｅ； ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ

云南蘿芙木（Ｒａｕｖｏｌｆｉａ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｔｓｉａｎｇ）為夾竹桃科蘿芙木（Ｒａｕｖｏｌｆｉａ）屬植物［１］。蘿芙木中含有利血平（Ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ）、育亨賓（Ｙｏｈｉｍｂｉｎｅ）、阿嗎堿（Ａｊｍａｌｉｃｉｎｅ）、利血胺、坎尼生等多種吲哚生物堿［２］。利血平具有降壓、鎮靜和安定作用，是一種常用的降壓藥［３］。育亨賓用于治療男性性功能障礙，同時還具有清風熱、降肝火、消腫毒的功效［４］。阿嗎堿有抗高血壓、鎮靜、抗血管擴張和抗菌作用［５］。目前國內對蘿芙木的研究主要集中在利血平和育亨賓的提取和檢測上，檢測方法主要為高效液相色譜法，但檢測方法僅針對其中一種或兩種生物堿，且同時檢測育亨賓和利血平的時間近１ ｈ［６，７］。本文建立了以甲醇－水－二乙胺為流動相，運用梯度洗脫的高效液相色譜法同時測定蘿芙木中育亨賓、利血平、阿嗎堿3種生物堿，測定時間為４０ ｍｉｎ，有效縮短了分析時間，為進一步研究蘿芙木的有效成分和質量控制提供依據。

１材料與方法

１．１儀器、試劑與材料

島津ＬＣ２０１０ＡＨＴ高效液相色譜儀，島津ＶＰ－ＯＤＳ Ｃ１８色譜柱（５ μｍ，４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ）。植物粉碎機、超聲波清洗儀。

育亨賓標準品（ｓｉｇｍａ），利血平標準品（ｓｉｇｍａ），阿嗎堿標準品（ｓｉｇｍａ），甲醇（色譜純），二乙胺（色譜純），其他試劑為分析純。

干燥的云南蘿芙木（產自云南省德宏州畹町地區），粉碎后過４０目篩，備用。

１．２方法

１．２．１育亨賓、阿嗎堿和利血平對照品溶液的制備精密稱取育亨賓標準品３．５ ｍｇ，阿嗎堿標準品２．４ ｍｇ，利血平標準品２．６ ｍｇ，育亨賓和阿嗎堿分別用甲醇溶解后定容到１０ ｍＬ，利血平用１ ｍＬ氯仿溶解后加甲醇定容到１０ ｍＬ。各取５ ｍL對照品溶液混合后定容到２５ ｍＬ，４ ℃避光保存，備用。

１．２．２云南蘿芙木浸提液的制備準確稱取云南蘿芙木粉末（４０目）５．０ ｇ，加入甲醇超聲３０ ｍｉｎ，超聲３次，每次加入溶劑量為５０、３０、２０ ｍＬ。超聲后抽濾，合并三次濾液定容到１００ ｍＬ，４ ℃避光保存，備用。

１．２．３色譜條件色譜柱：島津ＶＰ－ＯＤＳ Ｃ１８（４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，５ μｍ） 流動相：Ａ-甲醇；Ｂ-０．００４ ｍｏｌ／Ｌ二乙胺；梯度洗脫程序：０～２０ ｍｉｎ，６０％Ａ－４０％Ｂ；２０～４０ ｍｉｎ，Ａ：６０％→９５％，Ｂ：４０％→５％；流速：１ ｍＬ／ｍｉｎ；檢測波長２７８ ｎｍ；柱溫：３０ ℃。

２結果與分析

２．１色譜條件的優化

試驗對比了等度洗脫和梯度洗脫條件，當流動相為甲醇６０％~４０％（０．００４ ｍｏｌ／Ｌ二乙胺）水時，育亨賓在１８ ｍｉｎ時出峰，分離度較好，但此條件下阿嗎堿和利血平難以洗脫下來。因為利血平和阿嗎堿的極性比育亨賓小，所以采用梯度洗脫，增大流動相中甲醇比例，在２０~４０ ｍｉｎ之間，線性改變流動相配比，將甲醇比例由６０％線性變為９５％，而（０．００４ ｍｏｌ／Ｌ二乙胺）水由４０％線性改變為５％。此時阿嗎堿和利血平分別在３２ ｍｉｎ和３７．５ ｍｉｎ左右出峰，且與雜質峰分離效果好。最終確定流動相為０～２０ ｍｉｎ，６０％Ａ－４０％Ｂ；２０～４０ ｍｉｎ，Ａ：６０％→９５％，Ｂ：４０％→５％。

２．２標準曲線線性方程的建立

取混合對照品按１．２．１項下色譜條件分別進樣２、４、６、８、１０ μＬ，以峰面積為因變量，對照品含量為自變量進行線性回歸，得回歸方程見表１。圖１為混合對照品和浸提液的色譜圖。

２．３重現性和回收率試驗

取混合對照品溶液重復進樣５次，每次進樣１０ μＬ，計算出育亨賓的變異系數為１．１５％，阿嗎堿的變異系數為０．４８％，利血平的變異系數為１．１４％。

精確移取按１．２．２方法制備的提取液５ ｍＬ，分別加入準確質量的３種生物堿的標準品，經０．４５ μｍ微孔濾膜過濾，測得育亨賓的回收率為９６．４％，阿嗎堿的回收率為９５．５％，利血平的回收率為９６．３％。

２．４樣品測定

分別取云南蘿芙木根、莖、葉按１．２．２方法制備樣品溶液，經０．４５ μｍ微孔濾膜過濾，各進樣１０ μＬ進行分析，計算出３種生物堿的含量，結果見表２。

３小結

該法以甲醇－水－二乙胺為流動相，運用梯度洗脫，共同檢測了云南蘿芙木中育亨賓、阿嗎堿、利血平3種活性生物堿，測定時間約４０ ｍｉｎ，方法簡便，分離效果好，準確可靠，可用于中藥蘿芙木的質量控制。

目前研究報道主要針對蘿芙木中的利血平和育亨賓提取分離和檢測，未見有關蘿芙木中阿嗎堿色譜檢測方法的報道。試驗結果表明，阿嗎堿在蘿芙木中含量較為豐富，可進一步研究從云南蘿芙木中提取阿嗎堿的工藝，提高對蘿芙木的綜合利用。

試驗結果表明，3種生物堿在云南蘿芙木根莖葉中均能檢測到，只是各部位積累情況不同，有的含量很低。3種生物堿均在根部積累較多，在莖中含量也較為豐富，可考慮對蘿芙木全株進行綜合利用。在提取過程中應注意避光和控制操作溫度，以免見光分解和高溫損失。

參考文獻：

［１］ 曹福祥，徐慶軍，王承南，等．蘿芙木屬植物的物種和分布［Ｊ］．中南林業科技大學學報，２００７，27（６）：１５４－１５８．

［２］ 田學軍，龍云惠，何英，等．綠春蘿芙木資源薄層色譜鑒別［Ｊ］．紅河學院學報，２００５，３（６）：２３－２４．

［３］ 張志信，張仕秀，宋關斌． Ｄ１５１大孔樹脂－酸水法提取利血平的工藝研究［Ｊ］．藥物生物技術，２００４，１１（３）：１５７．

［４］ 陳琴華，張卓，朱軍，等． ＨＰＬＣ法測定育亨賓樹皮中育亨賓的含量［Ｊ］．中國藥房，２００７，１８（２８）：２２１３－２２１４．

［５］ 楊秀偉．生物堿［Ｍ］． 北京：化學工業出版社，２００５．

［６］ 龍云惠，田學軍，黃兆龍．ＨＰＬＣ測定中藥蘿芙木中育亨賓的含量［Ｊ］．云南民族大學學報（自然科學版），２０１０，１９（２）：１３７－１３９．

［７］ 劉宇，孫蕾，馮雷，等． 高效液相色譜法測定蘿芙木中育亨賓和利血平的含量［Ｊ］．中國生化藥物雜志，２００８，２９（４）：１０７－１０９．

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文