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黃孢原毛平革菌產木素過氧化物酶發酵條件的優化

2011-12-31 00:00:00王敏,王頡
湖北農業科學 2011年11期

摘要:對白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)產木素過氧化物酶的發酵條件進行了研究。在單因素試驗的基礎上用正交試驗進行工藝參數的優化。結果表明,木素過氧化物酶的最佳培養條件為培養13 d、接種0.5 mL,料液比1∶2.5(W/V,g∶mL)、培養溫度25℃,酶活為771 U/mL。

關鍵詞:白腐菌 Phanerochaete chrysosporium;木素過氧化物酶;正交試驗

中圖分類號:Q55文獻標識碼: A文章編號:0439-8114(2011)11-2305-03

Optimization of Production of Lignin Peroxidase by Phanerochaete chrysosporium

WANG Min1,2,WANG Jie2

(1.Department of Life Science, Hengshui University, Hengshui 053000,Hebei,China;

2.College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001,Hebei,China)

Abstract: The production craft of lignin peroxidase by white-rot fugi Phanerochaete chrysosporium was investigated. On the basis of single factor experiments, orthogonal experiment was used for the optimization of fermentation parameters. The result indicated that the optimal conditions were, the time of culture, 13d; the amount of inoculation, 0.5 mL; solid to liquid ratio, 1∶25(W/V,g∶mL)temperature, 25℃; lip activity, 771 U/mL.

Key words: white-rot fugi Phanerochaete chrysosporium; Lignin peroxidase; orthogonal experiment

白腐菌是已知的惟一能在純系培養中有效地將木質素降解為CO2和H2O的一類微生物[1,2],是迄今為止最有效、最主要的木質素降解微生物,在自然界的碳素循環中起著關鍵作用[3]。重要的木素降解酶有3種,木素過氧化物酶(Lignin peroxidase,LiP,EC.1.11.1.7)、錳過氧化物酶(Manganese-dependent peroxidase,MnP,EC.1.11.1.7)和漆酶(Laccase,EC.1.10.3.2)。LiPs是該酶系的主要成分,在木質素降解中起關鍵性作用。大多數白腐菌僅產生2種甚至1種分解木質素的酶[4-6]。木素降解酶不僅降解木質素,而且通過催化自由基鏈式反應,對環境中難降解有機污染物具有高效、廣譜的降解功能。故利用白腐菌處理工業廢水、生物制漿、土壤修復等是目前生物技術應用研究中的熱點課題。對黃孢原毛平革菌分泌胞外酶的條件進行優化,旨在對白腐菌的工業化應用和生物質的高效利用提供一定的理論依據。

1材料與方法

1.1材料

甜高粱秸稈,于2008年10月取自河北農業大學標本園,經烘箱干燥后用中藥粉碎機粉碎,過40目篩,備用;黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium),購自中國工業微生物菌種保藏中心;PDA培養基: 去皮馬鈴薯200 g,加水1 000 mL煮沸30 min,濾去馬鈴薯,濾液補足至1 000 mL,葡萄糖20 g,瓊脂15 g,121℃滅菌15 min。主要用于活化菌種;固態發酵培養基:甜高粱秸稈粉20 g,葡萄糖0.4 g,(NH4)2SO4 0.06 g,水40 g,121℃滅菌15 min。

1.2方法

1.2.1不同發酵條件對木質素酶活影響的正交試驗根據單因素試驗,確定最佳水平。進行正交試驗,因素與水平設計見表1。

1.2.2酶活測定粗酶液的制備:在秸稈發酵過程中,每2 d取出2 g發酵樣品,加入緩沖液浸提,30℃水浴振蕩浸提1 h。然后過濾,離心(3 500 r/min,15 min)后取上清液用于酶活測定。

木素過氧化物酶(LiP)活力測定[7]:取0.2 mL藜蘆醇溶液(10 mmol/L),0.4 mL酒石酸緩沖液(250 mmol/L,pH值為3.0)與0.4 mL粗酶液混勻,即得1 mL反應液。于30℃向此反應液中加20 μL H2O2溶液(20 mmol/L)啟動酶促反應,并在310 nm波長下測定反應1 min前后的反應液吸光度變化。一個酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化藜蘆醇產生1 μmol藜蘆醛所需的酶量。

2結果與分析

2.1不同發酵時間對酶活性的影響

不同發酵時間對黃孢原毛平革菌產木素酶活的影響見圖1。由圖1可知,發酵時間為14 d時,木素過氧化物酶酶活最高,為672 U/mL。

2.2不同碳源對酶活性的影響

碳源是構成菌體碳架及能量的來源,真菌細胞干重的1/2是由碳組成。碳源在真菌生長過程中占很重要的地位。白腐菌在降解木素時需要外加碳源,一般為糖類,高碳/低氮有利于木素降解[8]。試驗以不同碳源取代基礎培養基中的葡萄糖,考察它們對木質素酶合成的影響。在初始培養基中分別采用不同碳源(果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精),測定產酶狀況,發現酶活力隨不同碳源而異,如圖2所示。添加葡萄糖產生木素過氧化物酶的酶活最高,為720 U/mL,因此確定葡萄糖為木素過氧化物酶最佳碳源。

2.3不同氮源對酶活性的影響

在初始培養基中分別采用不同氮源(尿素、碳酸氫銨、草酸銨、檸檬酸三銨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸氫二銨、氯化銨),考察氮源對酶活的影響。由圖3可知,在以硝酸銨為氮源的培養物中木素過氧化物酶酶活最高,為722 U/mL。

2.4不同溫度對酶活的影響

微生物的增殖受溫度的影響較大。由圖4可知,在20、25、30℃下,木素過氧化物酶酶活差異較大,以25℃酶活最高。在此溫度下木素過氧化物酶酶活為722 U/mL。

2.5不同接種量對酶活的影響

接種量小會使發酵周期延長;接種量大能促進菌體迅速增殖,但會使培養基黏度增大,影響溶氧,衰老細胞增加,發酵后勁不足,發酵產物產量較小。由圖5可知,最佳接種量為1.0 mL,木素過氧化物酶酶活為696 U/mL。

2.6不同料液比對酶活的影響

固態發酵基質含水量是影響固態發酵的成功與否的關鍵。發酵初期,適當的濕度可以促進孢子的萌發和菌絲體的生長,濕度過大一方面會影響培養基的通透性,不利于散熱和氣體流通;另一方面, 若濕度過大,濕熱滅菌時培養基凝結成塊,菌絲體只能在團狀固體物料的表面生長,不能深入到內部,降低了菌絲體對固體物料的利用率。由圖6可知,物料與水分比例為1∶2.5(W/V,g∶mL,下同)時酶活最高,木素過氧化物酶酶活為699 U/mL。

2.7正交試驗

表2為正交試驗結果。由表2可知,影響木素過氧化物酶酶活的主次順序為D>B>A>C,即培養溫度>接種量>培養時間>料液比。最佳發酵條件為A2B1C3D2,即培養時間為10 d,接種量為0.5 mL, 料液比為1∶2.5,培養溫度為25℃,在此條件下進行驗證試驗,重復3次,木素過氧化物酶酶活為771 U/mL。

表3是正交試驗的方差分析結果。由表3可知培養時間、接種量、料液比、培養溫度4個因素中只有培養溫度對木素過氧化物酶酶活的影響顯著。

3結論

白腐菌系好氧菌,培養方式對產酶影響非常明顯。在試驗中采用振蕩培養白腐菌的方式,通過正交試驗確定了木素過氧化物酶的最佳培養條件為培養10 d、接種0.5 mL、料液比1∶2.5、培養溫度25℃,酶活可達771 U/mL。

白腐菌是一種能降解木質素的真菌,那么利用木質素類農業廢棄物如各種作物的秸稈作為培養基進行固體發酵,既滿足了白腐菌生長的原始生態環境而有利于其生長,同時又可以對農業廢物進行再利用,這樣不僅降低了大規模生產漆酶的成本,更重要的是減少了農業污染。

參考文獻:

[1] 孫漢鵬. 木腐菌及過氧化物酶在紙漿和煤炭生物處理方面的應用[D]. 濟南:山東大學,2005.

[2] KUMAR R, SINGH S, SINGH O V. Bioconversion of lignocellulosic biomass: biochemical and molecular perspectives [J]. J Ind Microbiol Biotechnol,2008,35:377-391.

[3] 劉友勛,郜金榮,黃娟. 白腐菌在兩種固體基質上的漆酶產量及同工酶活性比較研究 [J]. 氨基酸和生物資源,2007,29(3):33-35.

[4] ERIKSSON K E, BLANCHETTE R A, ANDER P. Microbial and enzymatic degradation of wood and wood components [M]. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag., 1990.

[5] ORTH A B, ROYSE D J, TIEN M. Ubiquity of lignin-degrading peroxidases among various wood-degrading fungi [J]. Appl Environ Microbiol,1993,59:4017-4023.

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[8] 阮芳勇. 青霉菌P6產木素過氧化物酶的發酵條件優化[D]. 北京:中國農業大學,2005.

注:本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文

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