豬γ干擾素的表達及抗病毒活性研究

摘要：利用ＲＴ－ＰＣＲ技術從有絲分裂原刀豆素（ＣｏｎＡ）誘導的長白豬外周血淋巴細胞總ＲＮＡ中擴增出豬γ干擾素的成熟肽基因（ｍＰｏＩＦＮ－γ），并將其亞克隆到原核表達載體ｐＥＴ－２８ａ中，構建重組表達載體ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ。經ＰＣＲ、酶切及測序鑒定后，轉化到大腸桿菌ＢＬ２１（ＤＥ３）進行ＩＰＴＧ誘導表達，經ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測，表明豬γ干擾素獲得了高效表達，并具有免疫活性，表達產物約為２０．５ ｋＤａ，主要以包涵體形式存在，產物經純化、復性得到具有生物學活性的蛋白。利用細胞病變抑制法對其在Ｈ－ＰＲＲＳＶ／Ｍａｒｃ－１４５系統上進行抗病毒活性測定，結果表明其抗Ｈ－ＰＲＲＳＶ活性為７．６８×１０３ Ｕ／ｍｇ。為進一步研究豬γ干擾素功能奠定了基礎和理論依據。

關鍵詞：豬γ干擾素；克??；原核表達

中圖分類號：Ｓ８５８；Ｑ７８文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）11－2283-04

Ｔｈｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ

ＬＩＡＮＧ Ｗａｎｇ－ｗａｎｇ１，２，ＺＨＯＵ Ｄａｎ－ｎａ１，ＹＡＮＧ Ｋｅ－ｌｉ１，ＬＩＵ Ｚｅ－ｗｅｎ１，ＤＵＡＮ Ｚｈｅｎｇ－ｙｉｎｇ１，ＤＥＮＧ Ｊｕｎ－ｈｕａ１，

ＧＵＯ Ｒｕｉ１，ＹＵＡＮ Ｆａｎｇ－ｙａｎ１，ＸＵ Ｄｉ－ｐｉｎｇ１，ＴＩＡＮ Ｙｏｎｇ－ｘｉａｎｇ１

（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Hｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Vｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｈｕｂｅｉ Kｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ， ｔｈｅ ｍａｔｕｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ （ｍＰｏＩＦＮ－γ） ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗｈｉｃｈ was ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｏｆ ＣｏｎＡ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｌａｎｄｒａｃｅ ｓｗｉｎｅ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＴ－２８ａ ｖｅｃｔｏｒ． Ａｆｔｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ， ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧ． Ｔｈｅ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ２０．５ｋＤａ，was existed mainly in inclusion body． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｒｅｎａｔｕｒａｌｉｚｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ＰｏＩＦＮ－γ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｈ－ＰＲＲＳＶ／Ｍａｒｃ－１４５ （ｖｉｒｕｓ／ｃｅｌｌ） ｔｅｓｔ ｓｙｓｔｅｍ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ＰｏＩＦＮ－γ ａｇａｉｎｓｔ Ｈ－ＰＲＲＳＶ ｗａｓ ７．６８×１０３ Ｕ／ｍｇ． Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｉｄ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｏＩＦＮ－γ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ γ （ＰｏＩＦＮ－γ）； ｃｌｏｎｅ； ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

１９５７年Ｉｓｓａｃｓ和Ｌｉｎｄｅｎｍａｎｎ從流感病毒感染的雞胚細胞培養液中分離到一種生物活性物質，因其可干擾同源和異源病毒復制，故命名為干擾素（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，ＩＦＮ）［１］。現研究表明，干擾素是人或動物細胞受到病毒感染等刺激后，由淋巴細胞、巨噬細胞及體細胞等產生的一類細胞因子，不僅具有廣譜抗病毒作用，還具有抗腫瘤和免疫調節等功能［２，３］。根據ＩＦＮ抗原性及分子結構差異，可將其分為３類：Ⅰ型干擾素，包括ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－τ和ＩＦＮ－δ等，主要起抗病毒作用；Ⅱ型干擾素，即ＩＦＮ－γ；新發現的Ⅲ型干擾素。

我國是養豬大國，豬病毒性傳染病種類多、危害大，雖然目前我國普遍接種豬病疫苗，但仍然不能很好的控制疫病?；蚬こ讨亟M豬干擾素具有無副作用、無藥物殘留等優點，為新型獸藥制劑。自２００６年以來高致病性藍耳病在我國暴發，給養豬業帶來了巨大損失，大量臨床研究也表明，干擾素為有效治療該病的首選藥物之一。ＩＦＮ－γ又稱免疫干擾素，主要由活化的Ｔ細胞和ＮＫ細胞產生，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等功能［２，４］。重組ＩＦＮ－γ對豬口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征以及豬水泡性口炎等病毒具有較好的抗病毒作用［５，６］，同時由于其免疫調節特性，可以增強疫苗的免疫效果，具有良好的應用前景。

該研究利用原核表達系統，在大腸桿菌中成功高效表達豬ＩＦＮ－γ，并初步研究了其對高致病性藍耳病病毒（Ｈ－ＰＲＲＳＶ）的抗病毒活性，為進一步研究豬ＩＦＮ－γ的抗病毒作用以及免疫調節作用提供了依據和基礎。

１材料與方法

１．１質粒、菌株和毒株

ｐＥＴ－２８ａ原核表達載體及宿主菌ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）均由動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室保存，高致病性藍耳病病毒湖北分離株（ＨＢＫＭ２株）由該實驗室分離和保存。

１．２試劑

豬淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品有限公司；ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ購自ＴａＫａＲａ和北京全式金公司；ＲＴ試劑盒、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ ＤＮＡ聚合酶購自日本東洋紡ＴＯＹＯＢＯ公司；ＲＮＡ提取試劑盒、限制性內切酶、Ｔ４ ＤＮＡ連接酶購自ＴａＫａＲａ公司；ＤＮＡ瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；鼠抗豬ＩＦＮ－γ單抗購自Ｓｅｒｏｔｅｃ公司；ＨＲＰ標記的兔抗鼠ＩｇＧ購自ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ公司。引物依據ＧｅｎＢａｎｋ上公布的基因序列而設計，由上海生工生物工程有限公司合成。ＰＧＳ（擴增ｍＰｏＩＦＮ－γ成熟肽基因上游引物）：５’－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＴＴＴ－３’（ＢａｍＨⅠ）；ＰＧＲ（擴增ｍＰｏＩＦＮ－γ成熟肽基因下游引物）：５’－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣ－３’（Ｈｉｎｄ Ⅲ）。

１．３淋巴細胞的分離、誘導及總ＲＮＡ的提取

前腔靜脈采集長白豬新鮮抗凝血１ ｍＬ，與Ｈａｎｋ’ｓ液１∶１混勻后，小心加于２ ｍＬ的淋巴細胞分離液的液面上，以２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，小心吸取淋巴細胞層，用５倍體積的ＲＰＭＩ １６４０洗滌２次，每次洗滌后１ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ。用含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ １６４０培養液稀釋重懸至１×１０６個／ｍＬ，加入６孔板中，于５％ ＣＯ２培養箱中３７ ℃培養１２ ｈ，換液并加入終濃度為１５ μｇ／ｍＬ的ＣｏｎＡ，繼續培養１２～２４ ｈ。收集淋巴細胞，按試劑盒說明書提取總ＲＮＡ。

１．４豬γ干擾素基因的擴增

按照逆轉錄試劑盒操作說明對淋巴細胞總ＲＮＡ進行反轉錄操作，利用高保真度的ＫＯＤ－ｐｌｕｓ ＤＮＡ聚合酶和引物ＰＧＳ／ＰＧＲ擴增豬γ干擾素的成熟肽基因（ｍＰｏＩＦＮ－γ）片段，反應條件為９４ ℃ ３ ｍｉｎ，９４ ℃ ２０ ｓ，６０ ℃ ４０ ｓ， ６８ ℃ １ ｍｉｎ，３５個循環后，６８ ℃ １０ ｍｉｎ。

１．５重組表達質粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ的構建

將ＰＣＲ產物用ＤＮＡ凝膠回收試劑盒回收，用ＢａｍＨⅠ和Ｈｉｎｄ Ⅲ分別對ｍＰｏＩＦＮ－γ基因擴增片段和ｐＥＴ－２８ａ載體質粒進行雙酶切、回收、連接構建重組質粒，命名為ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ。將連接產物轉化ＤＨ５α感受態細胞，篩選陽性克隆，提取質粒，進行ＰＣＲ、酶切鑒定和序列測定（由上海生工生物工程有限公司完成）。

１．６重組質粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ的原核表達與檢測

將重組質粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ和表達載體ｐＥＴ－２８ａ分別轉化大腸桿菌ＢＬ２１（ＤＥ３），挑取轉化子于含有卡那霉素（終濃度為５０ μｇ／ｍＬ）的ＬＢ培養基中，３７ ℃、２２０ ｒ／ｍｉｎ搖床培養至對數生長期（ＯＤ６００＝０．６～１．０）時，加入ＩＰＴＧ（終濃度為１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ）誘導表達３ｈ后，收集菌體，緩沖液重懸，進行超聲波破碎，離心取上清和沉淀，按文獻［７］所述的方法進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ所用的一抗為鼠抗豬ＩＦＮ－γ單抗，二抗為ＨＲＰ標記的兔抗鼠ＩｇＧ。

１．７重組豬γ干擾素（ｒＰｏＩＦＮ－γ）的純化與復性

將包涵體沉淀以含８ mol/L尿素的緩沖液變性溶解，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ后，收集上清，按說明書進行鎳柱純化，洗脫液中加入適量復性液，裝入透析袋，于４ ℃進行ＰＢＳ透析復性，期間更換透析緩沖液數次。復性后，采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法進行蛋白濃度測定，經０．２２ μｍ的濾膜過濾除菌后于－７０℃保存。

１．８重組豬γ干擾素的抗病毒活性測定

采用細胞病變抑制法測定重組ＰｏＩＦＮ－γ在Ｍａｒｃ－１４５細胞上抗Ｈ－ＰＲＲＳＶ的活性。９６孔細胞培養板培養Ｍａｒｃ－１４５細胞至單層后，加入１００ μＬ ２倍倍比稀釋的重組ＰｏＩＦＮ－γ，每一稀釋度設８個重復，３７ ℃培養２４ ｈ后，棄上清，加入１００ μＬ １００ ＴＣＩＤ５０的Ｈ－ＰＲＲＳＶ，設只用重組ＰｏＩＦＮ－γ處理不接毒對照組、正常細胞對照組和只接毒陽性對照組。接毒９６ ｈ后觀察細胞病變（ＣＰＥ）情況。采用Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法計算重組ＰｏＩＦＮ－γ蛋白的活性單位。

２結果

２．１ｍＰｏＩＦＮ－γ基因的擴增

以ＣｏｎＡ誘導的長白豬外周血淋巴細胞的總ＲＮＡ為模板，利用ＲＴ－ＰＣＲ方法擴增出豬γ干擾素的成熟肽基因（即去信號肽基因）ｍＰｏＩＦＮ－γ，瓊脂糖凝膠電泳結果表明擴增片段大小約為４３５ ｂｐ（圖１），符合預期。

２．２重組質粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ的酶切、測序鑒定

將構建的重組質粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ用ＢａｍＨⅠ和ＢａｍＨⅠ／Ｈｉｎｄ Ⅲ分別進行單、雙酶切鑒定，結果見圖２。由圖２可見，用ＢａｍＨⅠ單酶切可得到一條約５．８ ｋｂ的帶，用ＢａｍＨⅠ／Ｈｉｎｄ Ⅲ雙酶切則出現約５．３ ｋｂ的載體片段和約４３５ ｂｐ的外源片段（ｍＰｏＩＦＮ－γ）兩條帶。將重組質粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ送至上海生工生物工程有限公司進行序列測定，測序結果進一步證明ｍＰｏＩＦＮ－γ的成功擴增，且重組表達質粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ構建正確，未出現讀碼框“移碼”和終止突變等現象。

２．３重組質粒ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ表達與檢測

１５％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果表明（圖３），含ｐＥＴ－ｍＰｏＩＦＮ－γ重組質粒的Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１誘導后在約２０．５ｋＤａ處具有明顯的表達帶，大小與預期相符，而空載體轉化的對照菌株在此處未見此條帶。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析表明（圖４），表達的重組豬γ干擾素（ｒＰｏＩＦＮ－γ）能夠與抗豬ＩＦＮ－γ的單抗發生特異性的免疫反應，說明所克隆的ｍＰｏＩＦＮ－γ基因成功獲得了表達，并具有良好的免疫反應活性。

２．４重組豬γ干擾素的抗Ｈ－ＰＲＲＳＶ活性測定

表達的重組ＰｏＩＦＮ－γ包涵體蛋白經過柱純化和復性后，測得蛋白濃度為０．１１ ｍｇ／ｍＬ。采用Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法計算重組ＰｏＩＦＮ－γ蛋白的抗Ｈ－ＰＲＲＳＶ活性單位，能抑制５０％ Ｍａｒｃ－１４５細胞發生ＣＰＥ的干擾素稀釋度的對數ｌｏｇ２Ｘ＝距離比例+高于50%抑制病變比例的干擾素最高稀釋度的對數=（81.8%-50.0%）/（81.8%-30.0%）+（-7）=-6.4，即將重組ＰｏＩＦＮ－γ稀釋至２－６．４接１００ μＬ即可抑制５０％的細胞發生ＣＰＥ（表１），稀釋度Ｘ即為重組ＰｏＩＦＮ－γ的效價，可計算出Ｘ＝２６．４ Ｕ／１００ μＬ，即表達的重組豬γ干擾素抗Ｈ－ＰＲＲＳＶ／Ｍａｒｃ－１４５效價為８４４ Ｕ／ｍＬ，即７．６８×１０３ Ｕ／ｍｇ。

３討論

ＩＦＮ－γ為Ⅱ型干擾素，與Ⅰ型干擾素一樣，也具有抗病毒作用，但抗病毒性能不及Ⅰ型干擾素。由于ＩＦＮ－γ具有較強的免疫調節功能，主要表現在：（１）可誘導ＭＨＣ－Ⅰ類分子和ＭＨＣ－Ⅱ類分子的表達，從而提高抗原提呈能力；（２）參與輔助性Ｔ細胞的調節；（３）提高單核巨噬細胞和嗜中性白細胞的吞噬能力。所以，ＩＦＮ－γ在機體對病毒感染的長期抵御過程中起著非常重要的作用，也是機體細胞免疫的重要檢測指標之一，在疾病的診斷、預防和治療方面具有極大的應用前景。

ＩＦＮ－γ基因在正常情況下處于關閉狀態，當機體受到某些因素的刺激后方可表達，而且表達量低，故提取和純化天然的ＩＦＮ－γ難度大、成本高?；蚬こ谭椒ㄒ殉蔀椋桑疲危蒙a的主要手段，高產、低成本、低副作用等特點，使得重組ＩＦＮ－γ在臨床上廣泛應用。然而，相對人用干擾素，豬ＩＦＮ－γ的研究卻滯后許多。

ＰｏＩＦＮ－γ基因含有３個內含子和４個外顯子，所以我們用ＣｏｎＡ誘導豬外周血淋巴細胞，提取其總ＲＮＡ，進而通過ＲＴ－ＰＣＲ擴增出來。由于采用大腸桿菌表達系統，而外源蛋白的信號肽段會使表達的蛋白錨定在細胞膜上，從而嚴重影響表達量，所以擴增時我們去除了Ｎ端２３個氨基酸的信號肽序列，成功高效地表達了豬ＩＦＮ－γ的成熟肽基因。

此研究利用ｐＥＴ－２８ａ表達載體表達的重組ＰｏＩＦＮ－γ主要以包涵體形式存在，利用８ mol/L尿素對其進行變性溶解，由于重組蛋白攜帶有載體的Ｈｉｓ標簽，故可采用鎳柱進行純化。純化后的蛋白進一步采取透析復性方法進行蛋白的重折疊，使其恢復天然構象。通過對Ｈ－ＰＲＲＳＶ的抗病毒活性檢測表明，復性的重組ＰｏＩＦＮ－γ具有較好的生物活性。

總之，該研究利用大腸桿菌表達系統成功表達ＰｏＩＦＮ－γ，并進行了提純和復性，為進一步研究豬ＩＦＮ－γ的抗病毒、免疫增強和免疫佐劑功能奠定了基礎，并且為進一步臨床應用研究提供了前提。

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注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文