枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶條件的優(yōu)化

摘要：以枯草芽孢桿菌為試驗菌株，采用液態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵，探討枯草芽孢桿菌產(chǎn)α－淀粉酶的最佳發(fā)酵條件，分別對碳源、氮源、發(fā)酵時間、接種量、培養(yǎng)基初始ｐＨ進行單因素試驗，在此基礎上對碳源濃度、氮源濃度、接種量、培養(yǎng)基初始ｐＨ這４個因素進行了Ｌ９（３４）正交優(yōu)化試驗。結果表明，葡萄糖優(yōu)于其他碳源，尿素優(yōu)于其他氮源，最佳培養(yǎng)時間為３０ ｈ；最佳發(fā)酵參數(shù)組合為ｐＨ ５．０，葡萄糖質量濃度０．２％，尿素質量濃度１．５％，接種量２．５％。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；α－淀粉酶；最佳發(fā)酵條件；正交試驗

中圖分類號：Ｓ８１６．３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）11－2315-03

Ｏｐｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｍｙｌａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ sｕｂｔｉｌｉｓ

ＺＨＡＯ Ｗａｎｇ－ｆｅｎｇ１，ＺＨＯＵ Ｊｉｎｇ２

（1. Department of Economics and Managment， Binzhou 256600，Shandong，China；

2. College of Life Science，Qufu Normal University，Qufu 273165，Shandong，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｉｎｇａｌ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ α－ａｍｙｌａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ． Ｆｉｖｅ ｆａｃｔｏｒｓ， ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ， ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ， ｏｒｉｇｉｎａｌ ｐＨ， ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｉｚｅ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； and ｂａｓｅｄ ｏｎ these single factor tests， ｔｈｅ ｃａｒｂｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｏｒｉｇｉｎａｌ ｐＨ ｖａｌｕｅ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｉｚｅ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｉｎ Ｌ９（３４） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｗｅｒｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｃａｒｂａｍｉｄｅ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ３０ ｈ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｗａｓ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｐＨ ｖａｌｕｅ， ５．０； ｃａｒｂｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ０．２％； ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， １．５％； ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｉｚｅ， ２．５％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ； α－ａｍｙｌａｓｅ； ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的總稱，廣泛存在于動植物和微生物中。α－淀粉酶以內切方式水解淀粉底物的α－１，４糖苷鍵，水解產(chǎn)物為寡聚糖、麥芽糖和葡萄糖［１］，被廣泛應用于酒精發(fā)酵、啤酒釀造、葡萄糖制造、糊精制造、糖漿制造、紡織品退漿、銅版紙加工、洗衣業(yè)、飼料加工及醫(yī)藥生產(chǎn)等領域［２］。用于工業(yè)生產(chǎn)α－淀粉酶的主要生物為芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）［３］，其中枯草芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）廣泛存在于土壤、水中，由于其產(chǎn)酶量高、種類多、安全性好和環(huán)保等優(yōu)點，在現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應用［４］，本試驗通過研究枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶的影響因素，探討最佳發(fā)酵條件，為α-淀粉酶在實際生產(chǎn)中的廣泛應用提供依據(jù)。

１材料和方法

１．１試驗材料

１．１．１菌種枯草芽孢桿菌分離自山東省曲阜市污水處理廠。

１．１．２培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。

１．１．３主要試劑和溶液的配制磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液（ｐＨ ６．０）：稱取磷酸氫二鈉（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）４５．２３ ｇ、檸檬酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７·Ｈ２Ｏ）８．０７ ｇ，用蒸餾水溶解并定容至１ ０００ ｍＬ。配好后用ｐＨ計校正。質量濃度為２％的淀粉溶液：稱取可溶性淀粉２．０ ｇ，用少量蒸餾水調勻，徐徐傾入煮沸的水中，加熱煮沸至透明，冷卻后定容至０．１ Ｌ。

１．２試驗方法

１．２．１粗酶液制備將枯草芽孢桿菌接種在種子培養(yǎng)基上，３７ ℃培養(yǎng)１２ ｈ，使其活化；將活化的枯草芽孢桿菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，３７ ℃恒溫培養(yǎng)２４ ｈ后用漏斗過濾，取上清液，即為待測粗酶液。

１．２．２淀粉酶活力測定采用碘－淀粉法［５］測定酶活力：吸取２．０ ｍＬ質量濃度２％的淀粉溶液于試管中，加入磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液１．０ ｍＬ，搖勻，于４０ ℃恒溫水浴保溫５ ｍｉｎ。加入粗酶液１．０ ｍＬ，４０ ℃保溫３０ ｍｉｎ后，加入０．５ ｍｏｌ／Ｌ乙酸溶液５．０ ｍＬ，混勻。吸取反應液１．０ ｍＬ，加稀碘液５．０ ｍＬ，混合均勻。以蒸餾水作為空白參比，于６６０ ｎｍ波長測定其吸光度（Ａ）。從標準曲線算出被酶消耗的淀粉量。酶活力以每毫克粗酶液在４０ ℃，ｐＨ ６．０條件下每小時所分解的淀粉質量來衡量。

１．２．３單因素試驗在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基基礎上，分別改變培養(yǎng)基碳源、氮源、ｐＨ、接種量和培養(yǎng)時間，考察各因素對菌體產(chǎn)淀粉酶活力的影響。①改變培養(yǎng)基碳源為相同質量濃度的葡萄糖、蔗糖、牛肉膏或淀粉，接種量１．８８％，其他培養(yǎng)條件不變，測定各培養(yǎng)基產(chǎn)淀粉酶的差異。②以葡萄糖為碳源，改變培養(yǎng)基氮源為相同質量濃度的蛋白胨、尿素、硝酸銨或硫酸銨，接種量１．８８％，其他培養(yǎng)條件不變，測定各培養(yǎng)基產(chǎn)淀粉酶的差異。③以葡萄糖為碳源，尿素為氮源，接種量１．８８％，測定ｐＨ分別為５．０、６．０、７．０、８．０時各培養(yǎng)基產(chǎn)淀粉酶的差異。④以葡萄糖為碳源，尿素為氮源，調節(jié)各培養(yǎng)基初始ｐＨ為７．０，測定每４０ ｍＬ發(fā)酵培養(yǎng)基分別接種４００、６００、８００、１ ０００ μＬ種子培養(yǎng)基時產(chǎn)淀粉酶的差異。⑤以葡萄糖為碳源，尿素為氮源，調節(jié)培養(yǎng)基初始ｐＨ為７．０，接種量１．８８％，培養(yǎng)１２ ｈ后，每隔６ ｈ測１次酶活性，測定不同培養(yǎng)時間對菌體產(chǎn)淀粉酶的影響。單因素試驗中每個處理均設置３個重復。

１．２．４正交試驗在上述單因素試驗基礎上，對葡萄糖濃度、尿素濃度、初始pH和接種量４因素作了３水平的正交試驗，各因素及水平見表１。

２試驗結果

２．１碳源對菌體產(chǎn)淀粉酶的影響

測定不同碳源培養(yǎng)基產(chǎn)淀粉酶的活力，根據(jù)結果繪制圖１。可以看出，４種碳源對酶活力影響不同，葡萄糖作為碳源時，淀粉酶活力最大，但是與牛肉膏作碳源時酶活力差異不顯著，顯著高于蔗糖和淀粉作為碳源的酶活力（Ｐ＜０．０５）。所以，葡萄糖和牛肉膏可以作為最佳碳源。

２．２氮源對菌體產(chǎn)淀粉酶的影響

測定不同氮源培養(yǎng)基產(chǎn)淀粉酶的活力，根據(jù)結果繪制圖２。可以看出，氮源的不同對酶活力具有一定的影響，所產(chǎn)酶活力尿素＞蛋白胨＞硝酸銨＞硫酸銨，且尿素做氮源和其他３種氮源對酶活力的影響差異顯著（Ｐ＜０．０５），硝酸銨與硫酸銨對酶活力的影響沒有顯著差異。

２．３初始ｐＨ對菌體產(chǎn)淀粉酶的影響

考察不同初始ｐＨ對菌體產(chǎn)淀粉酶的影響，根據(jù)結果繪制圖３。由圖３可以看出，不同初始ｐＨ條件下產(chǎn)生的酶活力有差異，初始ｐＨ為７．０時產(chǎn)生的淀粉酶活力最大，但是在Ｐ＝０．０５水平上，各處理組酶活力差異不顯著，ｐＨ在５．０～７．０（中性偏酸）時，酶活相對較大。

２．４接種量對菌體產(chǎn)淀粉酶的影響

測定不同接種量條件下產(chǎn)生淀粉酶的活力，根據(jù)結果繪制圖４。可以看出，接種量不同，酶活力不同，不同接種量所產(chǎn)生淀粉酶的活力大小順序為：８００ μＬ、６００ μＬ、１ ０００ μＬ、４００ μＬ，其中８００ μＬ接種量產(chǎn)生的酶活力顯著高于與其他３個接種量（Ｐ＜０．０５）。

２．５培養(yǎng)時間對菌體產(chǎn)淀粉酶的影響

考察不同培養(yǎng)時間所產(chǎn)淀粉酶的活力，根據(jù)結果繪制圖５。可以看出，枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶不同培養(yǎng)時間酶活力不同，３０ ｈ和３６ ｈ的酶活性在Ｐ＝０．０５水平上差異不顯著，但是顯著高于２４、１８、４２ ｈ的酶活力（Ｐ＜０．０５）。因此，最適培養(yǎng)時間是３０ ｈ，在３０ ｈ以內酶的活性隨著時間的延長而升高，３０ ｈ后，所產(chǎn)酶的活性開始下降。

２．６正交試驗

在單因素試驗基礎上，對葡萄糖濃度、尿素濃度、初始pH、接種量４因素作３水平的正交試驗。由表２可以看出，對產(chǎn)酶活性影響最大的是培養(yǎng)基初始ｐＨ，其次是接種量和氮源濃度，葡萄糖濃度影響最小；最佳方案是ｐＨ ５．０，葡萄糖質量濃度０．２％，尿素質量濃度１．５％，接種量２．５％。

３討論與結論

３．１淀粉酶活力測定時的注意事項

酶活力測定受多種因素影響［６］，測定過程中應注意以下幾點：①取樣前，要把水浴鍋的水溫調到需要的溫度，保證各試管溫度一致，避免因水溫引起的誤差；②取樣時，速度要快、準確，避免樣品損失帶來的誤差；③酶反應時，先往反應管中加底物溶液，后加酶提取液，而且一次不要做太多的樣品，以避免加樣先與后的時間差異對試驗結果的影響；④加入乙酸，隔一段時間待乙酸完全終止反應后，再測吸光值；⑤測定吸光值時，先要檢查比色杯是否有差異，避免因比色杯差異引起的誤差；⑥用移液管量取液體時，應及時用蒸餾水沖洗，避免酶液間相互影響。

研究從碳源、氮源、培養(yǎng)基初始ｐＨ、接種量、培養(yǎng)時間５個單因素對枯草芽孢桿菌產(chǎn)α－淀粉酶的影響進行了探討，得出枯草芽孢桿菌在葡萄糖作為碳源，尿素作為氮源，培養(yǎng)基初始ｐＨ在５～７，接種量為２．５％，培養(yǎng)時間為３０ ｈ時，產(chǎn)生的淀粉酶活力相對較高。經(jīng)正交試驗分析，采取培養(yǎng)基初始ｐＨ ５．０，葡萄糖質量濃度0.2％，尿素質量濃度１．５％，接種量２．５％這種方案時枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的淀粉酶活力最高。

枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的蛋白酶、淀粉酶是工業(yè)酶中應用最為廣泛的酶，二者就占到了整個工業(yè)酶市場的５０％［７］。我國酶制劑工業(yè)近年來取得了長足的發(fā)展，但仍無法跟上世界同行業(yè)發(fā)展的步伐，科研乏力已成為制約中國酶工業(yè)發(fā)展的瓶頸因素。枯草芽孢桿菌作為一種安全、高效、多功能和極具開發(fā)潛力的微生物菌種已被廣泛應用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、畜牧業(yè)、水產(chǎn)等領域。隨著經(jīng)濟的發(fā)展、科研水平的提高，枯草芽孢桿菌與人們日常生活的關系將更為密切，它也必將作為一種十分重要的工業(yè)微生物菌種越來越引起人們的關注和青睞。本試驗通過研究枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶的若干影響因素，進而確定其產(chǎn)酶的最佳條件，為α-淀粉酶在實際生產(chǎn)中的廣泛應用提供依據(jù)。

參考文獻：

［１］ 谷軍．Α—淀粉酶的生產(chǎn)與應用［Ｊ］．生物技術，１９９４，４（３）：１－５．

［２］ 邱發(fā)福． 真菌 α—淀粉酶在面粉生產(chǎn)中的應用［Ｊ］． 糧油食品科技，１９９９，７（４）：２２－２３．

［３］ 楊慧，王振華，潘康成，等． 芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶活性的研究［Ｊ］． 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，２００７（２）：９０－９３．

［４］ 馬明，杜金華． 枯草芽孢桿菌酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應用［Ｊ］． 山東科學，２００６，１９（３）：３５－３８．

［５］ 劉賀紅，萬金泉，馬邕文，等． ＤＮＳ比色法測定污泥中淀粉酶活性的研究［Ｊ］． 安徽農(nóng)業(yè)科學，２００８（３３）：１４３６９－１４３７１．

［６］ 王霞，黃卓烈． １，４－環(huán)氧六環(huán)對α－淀粉酶催化活性的影響［Ｊ］． 河北化工，２００８（１２）：４０－４１．

［７］ 仇麗． 枯草芽孢桿菌在養(yǎng)殖中的應用［Ｊ］． 漁業(yè)現(xiàn)代化，２００２（４）：１．

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