HPLC檢測某些止咳中藥制劑中的克倫特羅

摘要：建立ＨＰＬＣ法測定止咳中藥制劑中非法摻入的化學止咳藥物克倫特羅。選用Ａｇｉlｅｎｔ Ｃ１８（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ）柱，以甲醇∶０．０１ ｍｏl／Ｌ磷酸二氫鉀溶液（磷酸調節ｐＨ值為３．５）＝２５∶７５（Ｖ／Ｖ）為流動相。根據所檢測到化合物的色譜保留時間，并與對照品比較，鑒別中藥制劑中非法摻入的克倫特羅。結果表明，試驗建立的條件能夠把中藥制劑中添加的止咳化學藥物（克倫特羅）完全分離出來；對２０種制劑用建立的分析技術進行了檢測，經與相應的標準物質比較，得到２０種樣品均未含克倫特羅。該方法選擇性強，靈敏度高，可作為分析檢測非法中藥制劑的有效手段。

關鍵詞：ＨＰＬＣ；止咳中藥制劑；克倫特羅

中圖分類號：Ｏ６５７．７＋２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）11－2334-03

Determination of Clenbuterol in Some Antitussive Traditional Chinese Medicines

by HPLC

ＬＩＵ Ｚｈｉ－ｙｏｎｇ１，ＣＨＥＮＧ Ｑｉ－ｌａｉ２，ＬＩ Ｈｏｎｇ－ｌｉａｎｇ２

（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ， Ｊｉ’ａｎ ３４３０００， Ｊｉａｎｇｘｉ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｇａｎｎａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇａｎｚｈｏｕ ３４１０００， Ｊｉａｎｇｘｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ ｍｉｘｅｄ ｉｌｌｅｇａｌｌｙ ｉｎ ｓｏｍｅ ａｎｔｉｔｕｓｓｉｖｅ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ｏｎ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃ１８（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ）ｗｉｔｈ ｍｅｔｈａｎｏｌ－０．０１ｍｏｌ／Ｌ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ （ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ ａｄｊｕｓｔ ｐＨ ｔｏ ３．５）＝２５∶７５（Ｖ／Ｖ） ａｓ ａ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ， ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｒｕｇ Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ ｍｉｘｅｄ ｉｌｌｅｇａｌｌｙ ｉｎｔｏ ＴＣＭ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ waｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ． Ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｃｏｕｌｄ ｅｎｔｉｒｅｌｙ ｓｅｐａｒａｔｅ ｔｈｅ Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ ｆｒｏｍ ＴＣＭ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ． Ｕｓｉｎｇ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ， ２０ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ， Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ ｗａｓ ｕｎｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ２０ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ high ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅａｎｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｉｌｌｅｇａｌ ＴＣＭ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＨＰＬＣ； antitussive ＴＣＭ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ； Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ

我國藥品市場上出現了在止咳中藥制劑中添加克倫特羅、沙丁胺醇、氨溴索等化學藥的現象［１］，面對此類違法行為，光憑肉眼很難識別，必須通過一定技術的檢測才能進行，現有單一的薄層色譜法、紫外分光光度法，已很難滿足檢測的要求，尤其在干擾成分多且量少的情況［２-５］。雖然現有ＨＰＬＣ－ＭＳ法可以解決此類問題，但儀器太昂貴，基層單位很難擁有，故根據實際需要，建立了ＨＰＬＣ法這種專屬性強、靈敏度高且基層適用的檢測技術，有很大的實際應用意義。

１材料與方法

１．１試劑及樣品

色譜純甲醇（Ｆｉｓｈｅｒ，美國）、去離子水。克倫特羅對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號：１０００７２－２００４０２。

共取２０種止咳中藥制劑作為測試樣品，分別編號為Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、 Ｓ１６、Ｓ１７、Ｓ１８、Ｓ１９、Ｓ２０，均為常用的市售止咳中藥。

１．２儀器設備

Ａｎｇlｉｅｎｔ １２００型高效液相色譜儀（美國Ａｇｉｌｅｎｔ公司）。

１．３方法

１．３．１檢測波長取克倫特羅對照品加甲醇制成１０ μｇ／ｍＬ的溶液。以甲醇為空白，置紫外可見分光光度計上，在４００～２００ ｎｍ的波長范圍內進行掃描。選擇克倫特羅的最大吸收波長。

１．３．２流動相及其組成分別試驗了甲醇＋水、甲醇＋醋酸銨溶液、甲醇＋磷酸二氫鉀溶液，經試驗確定哪種流動相峰形效果最好。

１．３．３緩沖溶液酸堿度分別試驗了ｐＨ值３．０、３．５、５．８的緩沖溶液對樣品的保留及分離的影響。結果以雜質峰的保留時間明顯減少、主峰峰形效果較好時為流動相的最佳ｐＨ值。

１．３．４對照品溶液的制備精密稱取克倫特羅對照品10．80 ｍｇ，置２５０ ｍＬ容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

１．３．５供試品溶液制備若供試品為片劑、丸劑、顆粒劑，研細，稱取一次最大服用劑量，置２５ ｍＬ容量瓶中，加甲醇２０ ｍＬ，超聲處理１５ min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液即得；若供試品為膠囊劑，取一次最大服用劑量內容物，研細，囊殼加水１０ ｍＬ加熱使溶解，其溶液與膠囊內容物混合，置２５ ｍＬ容量瓶中，再加甲醇１０ ｍＬ，超聲處理１５ min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得；若供試品為口服液，精密量取１０ ｍＬ，用１ ｍｏl／Ｌ氫氧化鈉調節ｐＨ值至１２，加入正丁醇－乙酸乙酯（１∶９）２０ｍＬ萃取兩次，有機相蒸干，殘渣滴加稀鹽酸２滴，精密加甲醇至２５ ｍＬ溶解，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

１．３．６陰性對照溶液的制備取處方中不含克倫特羅的止咳平喘類中成藥，按１．３．５的方法制備，即得。

１．３．７陽性對照溶液的制備精密稱取克倫特羅對照品１ ｍｇ，加入處方中不含克倫特羅的止咳平喘類中成藥中，混勻。按１．３．５的方法制備成陽性對照溶液。

２結果與分析

２．１ ＨＰＬＣ條件

色譜柱：Ａgilent Ｅｃlｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（５ μｍ，４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ）；柱溫：３０℃；流動相：甲醇∶０．０１ ｍｏl／Ｌ磷酸二氫鉀溶液（磷酸調節ｐＨ值為３．５）＝２５∶７５（V/V）；流速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；進樣量：１０ μＬ；檢測器：ＵＶ檢測器；檢測波長：２４３ ｎｍ。在此條件下，各對照品色譜圖如圖１。

２．２ 線性關系試驗

精密稱取克倫特羅對照品１０．８0 ｍｇ，置２５ ｍＬ容量瓶中，加甲醇定容至刻度。精密量取上述對照品溶液１．０、２．０、３．０、４．０、５．０ ｍＬ，置于１０ ｍＬ容量瓶中，加甲醇分別配制克倫特羅濃度為４３．２、８６．4、１２９．６、１７２．８、２１６．０ μｇ／ｍＬ的一系列溶液，以對照品濃度為橫坐標x，峰面積積分值為縱坐標y，繪制標準曲線，得線性回歸方程和相關系數為，＝

１７．０８０ ４５x－２７．８５２ ２，ｒ＝０．９９９ 6，試驗結果表明克倫特羅在４３．２～２１６．０ μｇ／ｍＬ之間線性關系良好。

２．３檢出限試驗

取１．３．４項下對照品溶液（４３．２ μｇ／ｍＬ）稀釋若干倍，精密吸取對照品溶液１０ μＬ，注入液相色譜儀，記錄主峰高約為噪音峰高３倍時的色譜圖，測得克倫特羅的檢出限為０．８６４ μｇ／ｍＬ（圖２）。

２．４精密度試驗

取１．３．４中對照品溶液，按色譜條件下方法，以１０ μＬ的進樣量分別注入色譜儀５次，記錄色譜圖，按克倫特羅峰面積計算，變異系數為１．２％（ｎ＝５），表明精密度良好。

２．５回收率試驗

精密稱取克倫特羅對照品１．２０ ｍｇ，照１．３．４項制備成對照品溶液。取１．１項下樣品Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３的一次最大服用量各３份，精密稱取克倫特羅對照品適量分別加入到上述樣品中，照１．３．５項下方法制備成供試品溶液，按色譜條件下方法進行回收率試驗，計算其平均回收率為８５．４％（表１）。

２．６重復性試驗

取１．３．５下供試品溶液各進樣５次，依法操作，變異系數為１．１％（ｎ＝５），表明該方法重復性良好。

２．７樣品測定

精密稱取克倫特羅對照品１２．３１ ｍｇ，照１．３．４項下方法制備成對照品溶液，取１．１項下樣品Ｓ１～Ｓ２０，照１．３．５項下方法制備成供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液與對照品溶液各１０ μＬ，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品色譜中，未呈現與對照品保留時間一致的色譜峰，檢測結果見表２。

３小結

１）由于液體制劑雜質峰干擾較多，因此液體制劑提取過程中先用混合溶劑萃取，除去部分雜質，再用甲醇提取。

２）以精密度試驗中系統適應性試驗的平均值為依據，理論板數按克倫特羅峰計算應不低于２ ５００。

３）由于處方中藥味較多，互相干擾較嚴重，相鄰峰與克倫特羅峰不易分離，曾試驗了甲醇－水、甲醇－醋酸銨溶液、乙腈－水等流動相，經大量試驗證明，甲醇＋０．０１ ｍｏl／Ｌ磷酸二氫鉀溶液峰形分離效果較理想。

參考文獻：

［１］ 王猛，孫忠親，宮瑞萍．ＨＰＬＣ測定喘舒片中鹽酸克侖特羅含量［Ｊ］．中成藥，２００３，２５（４）：３４３－３４４．

［２］ 董宇，孔璋，鐘大放．液相色譜－質譜聯用法檢測中藥降糖制劑中非法摻入的苯乙雙胍和格列本脲［Ｊ］．沈陽藥科大學學報，２００５，２２（１）：１９－２０．

［３］ 孫玉明，孫苓苓，鐘大放．液相－質譜聯用法檢測某些中藥制劑中的格列本脲［Ｊ］．藥物分析雜志，２００５，２５（３）：３２６－３２８．

［４］ 吳美香，黃麗彬．ＴＬＣ結合ＨＰＬＣ法檢測保健食品及中成藥中摻加化學降糖藥物的研究［Ｊ］．醫藥管理，２００７，１４（３）：１４８－１４９．

［５］ 鐘麗紅，凌霄，孫華． ＨＰＬＣ／ＭＳ２法檢測某些降糖中藥制劑中的雙胍類及磺酰脲類化學藥［Ｊ］．藥物分析雜志，２００８，２８（１０）：１６８３－１６８５．

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