多氯聯(lián)苯降解酶的分離純化及酶學性質研究

摘要：采用硫酸銨鹽析濃縮、透析、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０凝膠過濾層析，對表皮葡萄球菌產(chǎn)生的多氯聯(lián)苯（ＰＣＢｓ）降解酶進行分離純化。粗酶經(jīng)３０％～８０％飽和度硫酸銨沉淀法純化后比酶活可提高到４４２．２９ Ｕ／ｍｇ；經(jīng)透析后的比酶活可提高到４８０．７５ Ｕ／ｍｇ；最后經(jīng)凝膠層析法純化后的比酶活可提高到６ ９０３．５７ Ｕ／ｍｇ，純化倍數(shù)為３５．９，回收率為３０．５６％。酶催化反應的最適ｐＨ值為７．０；在ｐＨ值６．０～９．０，溫度為３０～４５℃時具有較好的穩(wěn)定性；Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋對酶有一定的抑制作用。

關鍵詞：ＰＣＢｓ降解酶；純化；酶學性質

中圖分類號：Ｘ１７２；Ｑ８１４．１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）11－2207-03

Purification and Characterization of the PCBs Degrading Enzyme

ＺＨＥＮＧ Ｑｉｎｇ－ｆｅｎｇ，ＳＨＡＯ Ｓｈａｎ－ｓｈａｎ，ＬＩ Ｈａｏ，ＺＨＡＯ Ｘｉａｏ－ｘｉａｎｇ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｏｎｇ Ｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１６２０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ＰＣＢ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ｂｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ， ｄｉａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０ ｇｅｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＢ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｏ ４４２．２９ Ｕ／ｍｇ ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ３０％～８０％ of （ＮＨ４）２ＳＯ４ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｓ， ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｏ ４８０．７５ Ｕ／ｍｇ ａｆｔｅｒ ｄｉａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｆｉｎａｌｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｏ ６ ９０３．５７ Ｕ／ｍｇ ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｇｅｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， as ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｌｄ ｗａｓ ３５．９； ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ rate ｗａｓ ３０．５６％． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ｏｆ ＰＣＢ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ７．０， ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ ａｔ ｐＨ ６．０~９．０ ａｎｄ ３０～４５ ℃． Ｃｕ２＋ ａｎｄ Ｆｅ２＋ ｈａｄ ｓｏｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｉｓ ｅｎｚｙｍｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＰＣＢ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ； pｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； eｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｙ

多氯聯(lián)苯（ＰＣＢｓ）是與苯環(huán)上碳原子相連接的氫被氯不同程度地取代而形成的一類聯(lián)苯化合物，廣泛用作電力設備（如變壓器、電容器）的絕緣液、油漆、塑料及無碳復寫紙的添加劑等。在生產(chǎn)消費過程中，ＰＣＢｓ被排放到環(huán)境中，引起了大范圍的長期污染，污染通過食物鏈對生物和人類產(chǎn)生影響，是一種致癌劑、致畸劑和致突變劑［１，２］。目前，ＰＣＢｓ污染的修復方法有高溫熱分解處理、微波、生物降解等。微生物法因低成本、無二次污染成為研究熱點［３－６］。在國內，微生物法研究側重于ＰＣＢｓ降解菌的篩選和降解特性方面；而在國外，除上述兩點外還有學者采用植物和微生物結合共同修復ＰＣＢｓ污染［７，８］。在ＰＣＢｓ降解菌株中報道較多的有假單胞菌屬、紅球菌屬、伯克霍爾德菌屬和腸桿菌屬［９－１４］。本研究對表皮葡萄球菌產(chǎn)生的ＰＣＢｓ降解酶進行分離與純化，并對其酶學性質進行了初步探究；以期為ＰＣＢｓ降解酶的研究提供理論參考。

１材料與方法

１．１材料及培養(yǎng)基

試驗用菌株表皮葡萄球菌從含有大量的油漆顆粒和清洗劑的污水中篩選獲得。

無機鹽培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀０．５ ｇ／Ｌ，磷酸氫二鉀０．５ ｇ／Ｌ，硫酸鎂０．２ ｇ／Ｌ，氯化鈣０．１ ｇ／Ｌ，氯化鈉０．２ ｇ／Ｌ，硫酸銨１．０ ｇ／Ｌ，ｐＨ值７．０。富集培養(yǎng)基：在無機鹽培養(yǎng)基中加入蛋白胨２．０ ｇ／Ｌ和聯(lián)苯１．０ ｇ／Ｌ。

１．２粗酶液的制備

將菌體投入含聯(lián)苯１．０ ｇ／Ｌ的１５０ ｍＬ富集培養(yǎng)基中，３０ ℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ培養(yǎng)７２ ｈ。用中速濾紙過濾發(fā)酵液除去未溶聯(lián)苯，所得菌液在４ ℃、８ ０００ ｒ／ｍｉｎ條件下離心１５ ｍｉｎ收集菌體。用ｐＨ值７．４的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液清洗菌體２次，懸浮。將菌體懸浮液置于冰浴中，超聲破碎細胞３０ ｍｉｎ，間隙時間３０ ｓ，工作時間３０ ｓ；所得即為粗酶液，分別測定其蛋白質含量和酶活性。

１．３蛋白質含量的測定

采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ考馬斯亮藍法測定，以牛血清白蛋白為標準蛋白質繪制標準曲線。

１．４酶活力的測定

取ｐＨ值７．４的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ３ ｍＬ，１ ｍｍｏｌ／Ｌ聯(lián)苯 １ ｍＬ，加入粗酶液１ ｍＬ，３５ ℃反應１ ｈ后，加入２．０ ｍＬ １０％的ＴＣＡ終止反應。４ ℃、８ ０００ ｒ／ｍｉｎ條件下離心１５ ｍｉｎ，取上清液于２９０ ｎｍ處測其吸光度。對照組為反應前加入ＴＣＡ。酶活力單位定義為：在上述條件下，１ ｍＬ酶液催化底物引起吸光度降低０．０１為１個酶活力單位（U）。比酶活＝酶活力單位／蛋白質含量，單位為Ｕ／ｍｇ。

１．５硫酸銨鹽析

向５ ｍＬ粗酶液中依次加入飽和度為０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％的硫酸銨，進行鹽析沉淀，攪拌使其完全溶解，４ ℃靜置過夜。４ ℃、

１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，收集上清液，測出蛋白質含量和酶活力，作鹽析曲線圖。

根據(jù)鹽析曲線圖，得到一級鹽析飽和度和二級鹽析飽和度。在粗酶液中加入硫酸銨至飽和度為一級，靜置過夜，４ ℃、８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ。在上清液中繼續(xù)添加硫酸銨至二級飽和度，靜置過夜，４ ℃、１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心３０ ｍｉｎ，沉淀用ｐＨ值７．４的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶解，裝入透析袋，４ ℃靜置過夜，測定蛋白質含量和酶活力。

１．６真空冷凍干燥

在真空冷凍干燥箱中干燥，時間不少于２４ ｈ。

１．７Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０ 凝膠層析

采用０．２ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ值６．８的磷酸緩沖液洗脫，洗脫速度０．５ ｍＬ／ｍｉｎ，每管收集３ ｍＬ；用核酸蛋白檢測儀檢測２８０ ｎｍ處光吸收。收集合并保存。

１．８ＰＣＢｓ降解酶酶學性質研究

１．８．１最適ｐＨ值和酸堿穩(wěn)定性在不同ｐＨ值的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中測定酶活力，以最高的酶活力計為１００％，其他酶活力以相對酶活力（相對酶活力指所測得的酶活力值與最高酶活力值的百分比，下同）表示；確定酶的最適ｐＨ值及其酸堿穩(wěn)定性。

１．８．２最適溫度和溫度穩(wěn)定性在不同溫度下測定酶活力，以最高酶活力計為１００％，其他酶活力以相對酶活力表示；確定酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性。

１．８．３金屬離子對酶活力的影響在加入不同種金屬離子后，分別測定酶活力，以最高的酶活力計為１００％，其他酶活力以相對酶活力表示；確定金屬離子對酶活的影響。

２結果與分析

２．１硫酸銨鹽析

不同飽和度的硫酸銨對粗酶液的鹽析情況見圖１。由圖１可知，飽和度在３０％～８０％內，酶活力下降較快，酶蛋白沉淀主要發(fā)生在此區(qū)間；飽和度＞８０％時，酶活力下降變得緩慢。因此，確定３０％和８０％分別為一級和二級鹽析飽和度。粗酶經(jīng)硫酸銨分級鹽析，可去除其中雜蛋白質，同時也可濃縮酶液。

２．２凝膠層析

硫酸銨鹽析試驗后的樣品用Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０進一步分離純化，如圖２所示，只出現(xiàn)一個比較明顯的蛋白峰，說明經(jīng)鹽析和透析后得到的成分較純。

２．３純化結果

各步純化結果見表１。可知ＰＣＢｓ降解酶經(jīng)過鹽析、透析和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０層析，得到較純的酶，其比酶活由粗酶的１９２．３０ Ｕ／ｍｇ提高到純酶的

６ ９０３．５７ Ｕ／ｍｇ，純化３５．９倍，回收率為３０．５６％。

２．４ＰＣＢｓ降解酶酶學性質

２．４．１酶反應的最適ｐＨ值由圖３可知，ＰＣＢｓ降解酶在ｐＨ值為７時，其相對酶活力達到最大值。此菌株所產(chǎn)酶屬于中性酶，這與相關報道的酶反應的最適ｐＨ值較類似［１５］。另外，酶的最適ｐＨ值并不是固定常數(shù)，受酶的純度、底物、緩沖液的種類等影響。

２．４．２酶反應的pH穩(wěn)定性由圖４可知，該酶在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定，但在堿性環(huán)境中有著較高的穩(wěn)定性。ｐＨ值小于６時，相對酶活力明顯下降；ｐＨ值為６時，相對酶活力高于８０％；ｐＨ值為７時，相對酶活力達到最大，為１００％；ｐＨ值大于７時，其對酶活力的影響并不大。

２．４．３酶的熱穩(wěn)定性由圖５可知，ＰＣＢｓ降解酶在３０ ℃條件下酶活力較穩(wěn)定，保溫３ ｈ后相對酶活力仍高于９０％；４５ ℃條件下保溫１ ｈ后相對酶活力降至５５％，而保溫３ ｈ后相對酶活力降為２０％；在高于６０ ℃條件下ＰＣＢｓ降解酶迅速失活，保溫１ ｈ時相對酶活力降至３０％。

２．４．４金屬離子對酶反應的影響由圖６可知，Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋對酶活力的影響較大，起到了一定的抑制作用；Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋對酶活影響不大；Ｎａ＋、Ａｌ３＋對酶活可能有一定的促進作用。

３小結

表皮葡萄球菌發(fā)酵產(chǎn)生的ＰＣＢｓ降解酶經(jīng)分離純化后，純化倍數(shù)達３５．９，回收率為３０．５６％。通過酶學性質的研究，ＰＣＢｓ降解酶在ｐＨ值為６．０～９．０，溫度為３０～４５℃時有較高的穩(wěn)定性，其最適ｐＨ值為７．０，Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋對酶活的影響較大，有一定的抑制作用。

參考文獻：

［１］ ＷＥＢＥＲ Ｋ， ＧＯＥＲＫＥ Ｈ． Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｏｒｇａｎｉｃ ｐｏｌｌｕｔａｎｔｓ （ＰＯＰｓ） ｉｎ ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｆｉｓｈ： Ｌｅｖｅｌｓ， ｐａｔｔｅｒｎｓ， ｃｈａｎｇｅｓ［Ｊ］． Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ， ２００３，５３（６）：６６７－６７８．

［２］ ＨＯＰＥ Ｂ， ＳＣＡＴＯＬＩＮＩ Ｓ， ＴＩＴＵＳ Ｅ． Ｂｉｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ ｂｉｐｈｅｎｙｌｓ ｉｎ ｂｉｏｔａ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｃｅａｎ ［Ｊ］． Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ， １９９８，３６（６）：１２４７－１２６１．

［３］ ＭＵＩＲ Ｄ Ｃ Ｇ， ＮＯＲＳＴＲＯＭ Ｒ Ｊ． Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｔｒｅｎｄｓ ｏｆ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｏｒｇａｎｉｃ ｐｏｌｌｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｒｃｔｉｃ ［Ｊ］． Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２０００，１１２－１１３：９３－１０１．

［４］ 趙毅，沈艷梅，馬蕭穎． 熱分解技術在修復多氯聯(lián)苯污染土壤中的應用［Ｊ］． 電力環(huán)境保護，２００９，２５（２）：５７－５９．

［５］ 王曄，王光龍． 微波降解水相中的多氯聯(lián)苯［Ｊ］． 化工進展，２００８，２７（７）：１０８５－１０８９．

［６］ 胡本濤，馬麗，劉蕊，等． 環(huán)境中多氯聯(lián)苯來源、結構關系與處理方法［Ｊ］． 化學與黏合，２００９，３１（４）：４４－４６．

［７］ ＳＹＴＶＥＳＴＲＥ Ｍ， ＭＡＣＥＫ Ｔ， ＭＡＣＫＯＶＡ Ｍ． Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｒｈｉｚｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ ｂｉｐｈｅｎｙｌｓ （ＰＣＢｓ） ［Ｊ］． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００９，２０（２）： ２４２-２４７．

［８］ ＶＲＣＨＯＴＯＶＡ Ｂ， ＦＲＡＮＣＯＶＡ Ｋ， ＭＡＣＫＯＶＡ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＢ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ （ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄｓ） ｂｙ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，

１３１（Ｓ）：２４２-２４９．

［９］ ＹＡＮＧ Ｘ Ｑ， ＳＵＮ Ｙ， ＱＩＡＮ Ｓ Ｊ． Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ ｂｉｐｈｅｎｙｌｓ ｂｙ ａ ｎｅｗｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ （Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｒ０４） ［Ｊ］． Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２００４，３１（９）：４１５－４２０．

［１０］ 任何軍，高松，張玉玲． 多氯聯(lián)苯降解菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＤＮ２的分離鑒定及其降解特性研究［Ｊ］． 環(huán)境科學，２００９，

３０（３）：８５７－８６３．

［１１］ 趙喆，張?zhí)m英，周佳欣． 降解多氯聯(lián)苯嗜鹽菌的分離和降解特性［Ｊ］． 吉林大學學報（地球科學版），２００７，３７（２）：３８０－３８３． ［１２］ 王維，沈波． 多氯聯(lián)苯降解菌Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＲＨＡ１的功能基因［Ｊ］． 杭州師范大學學報（自然科學版），２００８，７（５）：３７２－３７５．

［１３］ 孫立波，張?zhí)m英，趙喆，等． 一株多氯聯(lián)苯降解菌的分離鑒定及基因分型［Ｊ］． 吉林大學學報（理學版），２００７，４５（４）：６９１－６９５．

［１４］ 賈凌云． 多氯聯(lián)苯降解菌的篩選及其降解性能研究［Ｄ］． 大連：大連理工大學，２００８．

［１５］ 趙喆． 降解ＰＣＢｓ酶制劑及其對污染土壤的修復研究［Ｄ］． 長春：吉林大學，２００７．

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文