擬南芥LRR-RLK家族蛋白CLV1胞外域的可溶性表達與純化

摘要：大腸桿菌ＮｕｓＡ蛋白與擬南芥ＬＲＲ－ＲＬＫ家族蛋白ＣＬＡＶＡＴＡ１（ＣＬＶ１）胞外結構域（Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ， ＥＣＤ）融合表達，實現了蛋白ＣＬＶ１－ＥＣＤ的可溶性表達；ＣＬＶ１-ECD與其配體蛋白ＣＬＡＶＡＴＡ３（ＣＬＶ３）共表達，可以明顯提高它的水溶性。該實驗方法快速簡易地獲得了大量純化的ＣＬＶ１－ＥＣＤ蛋白，避免了包涵體變性與復性的復雜過程，為植物ＣＬＡＶＡＴＡ信號系統的進一步研究奠定了基礎。

關鍵詞：亮氨酸重復序列；ＣＬＡＶＡＴＡ１（ＣＬＶ１）；可溶性表達；胞外結構域；共表達

中圖分類號：Ｑ７８６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）11－2259-04

Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＲＲ－ＲＬＫ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＬＶ１ Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ

ＬＩ Ｆｅｎｇ，ＹＡＮ Ｘｉａｏ－ｊｉｎ，ＨＡＮ Ｃｕｉ－ｘｉａｏ，ＦＥＮG Ｄｕｏ，ＬＩ Ｑｉａｎ－ｑｉａｎ，ＧＡＯ Ｗｅｉ

（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｔｒｅｅ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ / Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＬＲＲ－ＲＬＫ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＬＡＶＡＴＡ１ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ （ＣＬＶ１－ＥＣＤ） ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ＮｕｓＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｅ． ｃｏｌｉ． Ｔｈｅ ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＬＶ１－ＥＣＤ ａｎｄ ｌｉｇａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＬＡＶＡＴＡ３（ＣＬＶ３） ｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＣＬＶ１－ＥＣＤ． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ａｖｏｉｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ′ｓ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ could ｏｂｔａｉｎ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｈｉｃｈ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ for ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ＣＬＡＶＡＴＡ ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ（ＬＲＲ）； ＣＬＡＶＡＴＡ１（ＣＬＶ１）； ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ； ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

植物體莖端分生組織（Ｓｈｏｏｔ ａｐｉｃａｌ ｍｅｒｉｓｔｅｍ，ＳＡＭ）是植物體胚后發育所有地上部分（Ａｅｒｉａｌ ｐａｒｔｓ）器官發生的源泉，高等植物最終形態主要依賴于ＳＡＭ發育調控［１］。ＳＡＭ的干細胞分化與分裂之間的平衡由ＣＬＡＶＡＴＡ基因與ＷＵＳＣＨＥＬ（ＷＵＳ）組成的負反饋調節環控制［２］。ＣＬＡＶＡＴＡ基因（ＣＬＶ１，ＣＬＶ２，ＣＬＶ３）通過抑制轉錄因子ＷＵＳ的表達來限制干細胞的數目，促進干細胞的分化，而ＷＵＳ轉錄因子的表達可促進ＣＬＶ３基因的表達，從而維持干細胞特性［３－５］。

ＣＬＶ１基因編碼一個由９８０個氨基酸組成的１０５ ｋｕ的膜蛋白，該蛋白具有３個結構域，即由２１個亮氨酸重復序列（Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ，ＬＲＲ）組成的胞外結構域（Ectodomain，ECD）、單次跨膜區和一個胞內ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ激酶區組成，屬于富亮氨酸重復的類受體蛋白激酶（ＬＲＲ－ＲＬＫ）家族。最近日本研究人員利用光親和標記（Ｐｈｏｔｏ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌａｂｅｌｉｎｇ）技術證明了多肽信號ＣＬＶ３是直接與ＣＬＶ１的胞外結構域（CLV1-ECD）結合的，而胞內激酶區對多肽信號的結合力沒有影響［６］。CLV1-ECD共有６１５個氨基酸，由２１個ＬＲＲ基序組成，疏水氨基酸占到了４６．５％，其中有９３個亮氨酸和４５個異亮氨酸。Ｗｉｋｉｎｓｏｎ等［７］和Ｓｍｉａｌｏｗｓｋｉ等［８］的研究表明蛋白質異源表達的可溶性與氨基酸的組成有很大關系，而亮（異亮）氨酸含有較長的疏水性脂肪族側鏈基團，在水中的溶解度極小。因此該類蛋白在原核表達過程中常常形成包涵體，不利于下一步結構與功能的研究。

本實驗擬用載體質粒ｐＥＴ４４ａ攜帶的大腸桿菌ＮｕｓＡ蛋白與擬南芥ＣＬＶ１-ECD融合表達，實現ＣＬＶ１－ＥＣＤ的可溶性表達，經親和層析純化可得到純度較高的融合蛋白ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ。在兩種抗生素的選擇壓力下，使兩個不相容的質粒（ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ和ｐＥＴ４８ｂ－ＣＬＶ３）在大腸桿菌中穩定存在并實現外源蛋白ＣＬＶ１－ＥＣＤ與其配體蛋白ＣＬＶ３共表達，進一步提高其水溶性。本研究是首次報道擬南芥ＣＬＶ１的胞外結構域在大腸桿菌表達體系中的可溶性表達，可為研究植物ＣＬＡＶＡＴＡ信號通路的分子機理奠定生化基礎。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１細胞、菌株和質粒大腸桿菌感受態細胞ＤＨ５α及ＢＬ２１（ＤＥ３）和質粒載體ｐＥＴ４４ａ均為本實驗室保存；質粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１－ａｔＣＬＶ１和ｐＥＴ４８ｂ－ＣＬＶ３為中國科學院植物研究所劉春明研究員提供。

１．１．２主要儀器與試劑ＦａｓｔＰｆｕ聚合酶購自Ｔｒａｎｓｇｅｎ公司；Ｘｈｏ Ｉ，Ｂａｍ ＨＩ，Ｔ４ ＤＮＡ連接酶和蛋白質分子量標準購自美國ＮＥＢ公司；ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ為廣州東盛生物科技有限公司產品；ＩＰＴＧ、氨芐青霉素和卡那霉素購自德國Ｍｅｒｃｋ公司；ＤＮＡ凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂購自瑞典ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ公司；核酸電泳儀和蛋白質電泳儀為美國Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司產品；其他試劑均為國產分析純。

１．２方法

１．２．１擬南芥ＣＬＶ１－ＥＣＤ的ＰＣＲ擴增根據ＮＣＢＩ公布的擬南芥ＣＬＶ１基因序列設計上下游引物擴增其胞外結構域片段ＣＬＶ１－ＥＣＤ（７３－１ ９１４ ｂｐ）。引物序列如下：ＦＰ： ５′ＡＡＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧ

ＡＧＴＴＣＴ ３′（下劃線為Ｂａｍ ＨＩ酶切位點）；ＲＰ： ５′ＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＣＴＴＧＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣ ３′（下劃線為Ｘｈｏ Ｉ酶切位點）。以質粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１－ａｔＣＬＶ１為模板，進行ＰＣＲ擴增。擴增體系為：模板質粒ＤＮＡ ０．１ μｇ，１０× Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ １．６ μＬ，正反向引物各４ μｍｏｌ，ＦａｓｔＰｆｕ聚合酶０．２ μＬ，加去離子水至２０ μＬ。反應程序為：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，５５ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３０個循環；７２ ℃后延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ反應產物進行１．０％瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶用ＤＮＡ凝膠回收試劑盒回收。

１．２．２ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ重組質粒的構建上述純化后的ＰＣＲ產物ＣＬＶ１－ＥＣＤ以及表達載體ｐＥＴ４４ａ質粒用Ｂａｍ ＨＩ和Ｘｈｏ Ｉ雙酶切，分別回收后用Ｔ４ ＤＮＡ連接酶１６ ℃過夜連接。連接產物轉化ＤＨ５α感受態細胞，涂布含１００ μｇ／ｍＬ氨芐青霉素的固體ＬＢ平板，３７ ℃培養箱倒置過夜培養后隨機挑取單菌落，做菌落ＰＣＲ。取菌落ＰＣＲ呈陽性的重組子，提取質粒ＤＮＡ，并用Ｂａｍ ＨＩ和Ｘｈｏ Ｉ雙酶切進一步鑒定。將鑒定正確的重組質粒送往北京華大基因研究中心測序。

１．２．３ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ重組蛋白的表達、可溶性分析和純化把重組質粒ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ轉化表達菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）感受態細胞，挑取單克隆菌落接種于含１００ μｇ／ｍＬ氨芐青霉素的ＬＢ液體培養基中，３７ ℃振蕩培養至ＯＤ６００nm約為０．６時，取出５００ μＬ菌液作對照后加入ＩＰＴＧ至終濃度為０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ，３７ ℃誘導表達３ ｈ，收集菌體。取出５００ μＬ菌液，用１２％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳鑒定表達情況。

將５００ ｍＬ誘導過的菌液用大容量低溫離心機離心收集菌體，然后用３０ ｍＬ裂解液（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ值８．０，３００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）重懸菌體，并加入ＰＭＳＦ至終濃度為１ ｍｍｏｌ／Ｌ，冰浴超聲破碎。將菌體裂解液在高速冷凍離心機上，１５ ０００ ｒ／ｍｉｎ，４ ℃離心３０ ｍｉｎ后，分別取上清和沉淀，用１２％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳鑒定ＣＬＶ１－ＥＣＤ融合蛋白的可溶性。取上清加入預平衡好的親和樹脂，用Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ沖洗層析柱，然后用Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ洗脫目的蛋白。純化的蛋白進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳檢測其純度。在酶解反應液（２０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ值８．４，２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２）中，用蛋白酶Ｔｈｒｏｍｂｉｎ切除重組融合蛋白ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ的ＮｕｓＡ標簽。

１．２．５ＣＬＶ１－ＥＣＤ與其配體蛋白ＣＬＶ３共表達分別取構建成功的表達質粒ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ和ｐＥＴ４８ｂ－ＣＬＶ３各２ μＬ，將其混合均勻，然后用熱激法轉化ＢＬ２１（ＤＥ３）感受態細胞，并將菌液涂布在含有３０ μｇ／ｍＬ卡那霉素和５０ μｇ／ｍＬ氨芐青霉素雙重抗性的ＬＢ固體培養基平板上，３７ ℃倒置過夜培養。次日，挑取陽性菌落于含有５０ μｇ／ｍＬ卡那霉素和１００ μｇ／ｍＬ氨芐青霉素雙重抗性的ＬＢ液體培養基中３７ ℃過夜培養并提取質粒ＤＮＡ。由于表達質粒ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ和ｐＥＴ４８ｂ－ＣＬＶ３中都有一個Ｘｈｏ Ｉ酶切位點，所以用Ｘｈｏ Ｉ把質粒切成線狀，用來鑒定共轉成功的菌落。剩余的菌液用終濃度為０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ在１６ ℃條件下誘導表達。取樣進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳，對比共表達與單獨表達上清中ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ的含量。用Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂純化共表達產物。

２結果

２．１ＰＣＲ擴增產物ＣＬＶ１－ＥＣＤ及ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ重組質粒的鑒定

擬南芥ＣＬＶ１－ＥＣＤ的ＰＣＲ擴增產物經１％瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示其片段大小與預期的１ 842 ｂｐ相符（圖１）。ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ重組質粒用Ｂａｍ ＨＩ／Ｘｈｏ Ｉ雙酶切得到的兩條條帶與預期相符（圖２）。

２．２重組蛋白的原核表達與純化

帶有Ｈｉｓ標簽的重組蛋白ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ理論相對分子質量應為１３０ ｋｕ。利用Ｈｉｓ標簽與Ｎｉ＋螯合原理，純化得到了重組蛋白ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ（圖３）。在酶解緩沖液中，適量的蛋白酶Ｔｈｒｏｍｂｉｎ與融合蛋白ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ酶切反應，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳表明蛋白酶可以切除ＮｕｓＡ標簽并得到蛋白樣品ＣＬＶ１－ＥＣＤ（圖４）。

２．３ＣＬＶ１－ＥＣＤ與其配體蛋白ＣＬＶ３共表達

提取共轉菌落的質粒用ＸｈｏⅠ單酶切，瓊脂糖凝膠檢測出現兩條線性的ＤＮＡ片段（９ ０００ ｂｐ和

７ ４００ ｂｐ），與預期結果相符（圖５）。重組質粒ｐＥＴ４８ｂ－ＣＬＶ３的表達產物為融合蛋白ＴＲＸ－ＣＬＶ３，分子量為２０ ｋｕ。分別取等量誘導后的菌液和誘導前的菌液，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳顯示誘導組中出現兩條蛋白條帶（即１３０ ｋｕ和２０ ｋｕ的蛋白條帶），而單獨表達僅出現一條１３０ ｋｕ或２０ ｋｕ的蛋白條帶（圖６）。將菌體裂解液高速離心后，取上清和沉淀，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳顯示共表達上清中的ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ量明顯比單獨表達上清中的量高，表明受體蛋白ＣＬＶ１－ＥＣＤ與其配體蛋白ＣＬＶ３的共表達可以提高ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ的可溶性（圖７）。共表達產物利用Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂純化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳顯示兩條蛋白條帶，分別為蛋白ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ與ＴＲＸ－ＣＬＶ３（圖８）。

３討論

ＮｕｓＡ蛋白是大腸桿菌的蛋白－轉錄抗終止因子，分子量為５５ ｋｕ，能顯著提高與其融合表達的目標蛋白水溶性。如人白介素－３單獨表達或與硫氧還蛋白融合表達［１２］時都是包涵體形式的蛋白，而含有ＮｕｓＡ標簽的人白介素－３融合蛋白在３７ ℃條件下誘導表達幾乎全部可溶（９７％）［１１］。本實驗利用ＣＬＶ１－ＥＣＤ與ＮｕｓＡ融合表達，實現了ＣＬＶ１－ＥＣＤ的可溶性表達。

復制子相同的質粒在宿主菌內存在不相容現象，在復制及隨后分配到子細胞的過程中彼此競爭，很快導致兩種質粒拷貝數失衡，幾代后其中一種質粒就可能丟失，不能在同一大腸桿菌共存［１３］。已有研究報道利用兩種抗生素的選擇壓力，可以使兩個不相容的質粒在大腸桿菌中穩定存在并表達外源蛋白［１４］。本實驗利用氨芐青霉素抗性質粒ｐＥＴ４４ａ和卡那霉素抗性質粒ｐＥＴ４８ｂ分別構建原核表達質粒ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ和ｐＥＴ４８ｂ－ＣＬＶ３，在氨芐青霉素和卡那霉素雙重選擇壓力下，兩種質粒能夠在ＢＬ２１（ＤＥ３）中穩定共存并可以共表達蛋白。由于受體與配體的特異性結合與相互作用，不僅可以促進目的蛋白ＣＬＶ１－ＥＣＤ在大腸桿菌表達體系中能盡可能正確的折疊，同時還可以隱藏一些疏水氨基酸，使其不暴露在蛋白的外部，從而提高了ＣＬＶ１－ＥＣＤ蛋白的可溶性。

該研究成功實現了ＣＬＶ１－ＥＣＤ在大腸桿菌高效可溶表達，并且可以快速制備大量純化的ＣＬＶ１－ＥＣＤ蛋白，為研究該結構域的功能打下了基礎。同時該研究提到的提高外源蛋白在原核表達體系中可溶性表達的方法，為同類問題的解決提供了一個新的思路。

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