營養條件對三角褐指藻生長和油脂積累的影響

摘要：研究了培養基中添加乙酸鈉、尿素以及Ｆｅ３＋對三角褐指藻（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）生長和油脂積累的影響。結果表明，培養基中添加乙酸鈉作為碳源的兼養生長模式對三角褐指藻的生長和油脂含量的增加有明顯的促進作用（Ｐ＜０．０５），在乙酸鈉濃度為５．０ ｇ／Ｌ時得到最大生物量為１．２８ ｇ／Ｌ，是對照的１．７倍；而在乙酸鈉濃度為０．５ ｇ／Ｌ時油脂含量達到最大（２８．９０％），是對照的１．９倍；培養基中添加適當濃度的尿素作為氮源，可以顯著地提高三角褐指藻的生長速率（Ｐ＜０．０５），但對生物量和油脂含量沒有顯著影響（Ｐ＞０．０５）；培養基中Ｆｅ３＋濃度的增加對三角褐指藻的生長速率、生物量及油脂積累均沒有顯著影響（Ｐ＞０．０５）。

關鍵詞：三角褐指藻；乙酸鈉；尿素；Ｆｅ３＋；生物量；比生長速率；油脂積累

中圖分類號：Ｑ９４９．２７文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）11－2292-03

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｏｉｌ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ

ＦＵ Ｒｕ１，２，ＨＵＡＮＧ Ｃｈａｎｇ－ｇａｎ２，ＷＡＮＧ Ｈａｉ－ｙｉｎｇ１

（１． Ｋｅｙ Ｌａｂ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｓｏｕｔｈ－ｃｅｎｔｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００７４，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｉａｎｇｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００４５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｅｆｆｅｃｔｓ ｔｏ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｏｉｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ａｄｄｅｄ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ， ｕｒｅａ ａｎｄ Ｆｅ３＋． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ was ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｏｉｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ａｓ ａ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｘｍｉｕｍ ｂｉｏｍａｓｓ ａｐｐｅａｒｅｄ ａｓ １．２８ ｇ／Ｌ ｗｈｅｎ ｕｓｅｄ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ５．０ ｇ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ａｎｄ ｓｈｏｗｅｄ １．７ ｔｉｍｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｏｉｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ２８．９０％ ｗｉｔｈ ０．５ ｇ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ， ａｎｄ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ １．９ ｔｉｍｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｈｅｎ ｕｓｅｄ ｔｈｅ ｕｒｅａ ａｓ ｔｈｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ（P＜0.05）， ｂｕｔ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｉｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｃｈａｎｇｅｄ（P＞0.05）． Ｔｈｅｒｅ waｓ ｎｏ ｅｆｆｅｃｔ ｔｏ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ， ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｏｉｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ｂｙ ａｄｄing Ｆｅ３＋ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ； ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ； ｕｒｅａ； Ｆｅ３＋； ｂｉｏｍａｓｓ； specific ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ； ｏｉｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ

由于全球經濟一體化的不斷發展，對化石能源的需求和消耗迅猛增長，因此發展替代能源是保障能源安全和自然平衡的重大戰略舉措。藻類具有光合作用效率高、環境適應能力強、生長周期短、生物產量高的特點，是生產生物質能的潛在資源，成為當今國內外的研究熱點［１］。

通過改變培養基中的化學成分來控制微藻的新陳代謝從而提高微藻的生物量和油脂含量是當今研究的熱點之一，但這類研究多集中于小球藻（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）［１］。三角褐指藻（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）在分類學上隸屬于硅藻門，油脂含量可達干重的１５．６％～３１．５％，因富含多不飽和脂肪酸（Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ，ＰＵＦＡ）而被廣泛地應用于水產餌料，是一種極有開發潛力的優質經濟藻種。對于三角褐指藻的生長條件和培養基中營養鹽成分對其影響的研究，主要集中在對油脂中多不飽和脂肪酸組成的改變和生長調控方面，通過提高藻油中ＰＵＦＡ所占比例以提高其營養價值［２］。但對于通過調整培養基同步提高三角褐指藻的生物量和油脂含量的研究尚不多見，提高油脂產率的培養條件還不明確。王付冬等［３］和夏金蘭等［４］分別探討了不同Ｆｅ３＋濃度和光照條件對三角褐指藻生長、總脂含量的影響，這些研究結果顯示，通過改變生長條件可以調控三角褐指藻的脂類物質積累。

藻的培養主要是進行光合自養，加入有機碳源的兼養培養方式被認為是一種可以實現藻的高密度生長的方式，但兼養模式下三角褐指藻油脂積累的研究還很少。為探討培養基成分對三角褐指藻生長和富集油脂的影響，本研究采用水產餌料生產中常用的硅藻培養液，考察了添加乙酸鈉、尿素及Ｆｅ３＋對三角褐指藻生長和油脂積累的影響，為三角褐指藻用于生物質能開發提供有價值的參考。

１材料與方法

１．１藻種

三角褐指藻（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）來自中南民族大學生命科學學院發酵工程實驗室，經抗生素法制備無菌藻株。

１．２培養基

基礎培養基配方由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供，成分如下：ＮａＮＯ３ ０．０５ ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ ０．００５ ｇ／Ｌ，１％的檸檬酸鐵溶液０．１ ｍＬ／Ｌ，尿素０．０５ ｇ／Ｌ，維生素Ｂ１２ ２×１０－７ ｇ／Ｌ，維生素Ｂ１ ２×１０－７ ｇ／Ｌ，土壤提取液２０ ｍＬ／Ｌ，人工海水定容至１ ０００ ｍＬ，鹽度為2.5%（質量濃度）。按照試驗設計分別加入不同濃度的乙酸鈉、尿素和ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ，均為分析純。

１．３試驗方法

分別進行碳源、氮源和鐵鹽的影響試驗，每個濃度做３個平行。以基礎培養基作為對照，選取乙酸鈉為碳源，設置０．５、１．０、２．０、５．０ ｇ／Ｌ ４個濃度梯度進行碳源影響試驗。以沒有添加尿素和硝酸鈉的基礎培養基作為對照，以尿素為氮源，設置６０．１、１２６．１、２３４．２、４８０．５ ｍｇ／Ｌ ４個濃度梯度進行氮源影響試驗。以沒有添加檸檬酸鐵鹽的基礎培養基作為對照，選取ＦｅＣｌ３·6H2O替代檸檬酸鐵作為鐵鹽，設置３．２、６．３、９．５、１９．０、３４．７ ｍｇ／Ｌ ５個濃度梯度進行鐵鹽影響試驗。培養溫度為（２０±１）℃，光照強度為３ ５００ ｌｘ，光暗比為１２Ｌ∶１２Ｄ，靜置培養，每天搖藻并隨機更換三角瓶位置，以避免光照不勻，培養時間為１４ ｄ。

１．４比生長速率的測定

μ＝（ｌｎＮ２－ｌｎＮ１）／（ｔ２－ｔ１），其中μ為比生長速率（ｄ－１），ｔ為生長時間（ｄ），Ｎ２和Ｎ１分別是三角褐指藻在ｔ２和ｔ１時刻的生物量（ｇ／Ｌ）。

１．５生物量的測定

從接種當天開始，隔天取藻液測定５４０ ｎｍ處的光密度。根據標準曲線回歸公式ｙ＝０．３９２Ａ－０．００９ （ｒ＝０．９９７ ８）換算成生物量，其中，ｙ為生物量（ｇ／Ｌ），Ａ為光密度。

１．６油脂含量的測定

采用離心法收集微藻細胞，培養液在１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ條件下離心５ ｍｉｎ，棄上清，藻細胞沉淀用去離子水洗滌２次再離心，收集的藻細胞用冷凍干燥法進行干燥，干燥后的藻粉稱重，保存待用。

用氯仿-甲醇法［５］提取油脂，測定干燥藻粉的油脂含量。

油脂含量＝（油脂質量／干燥藻粉質量）×１００％。

１．７數據處理

用統計軟件ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５的單因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）中的Ｄｕｎｎｅｔｔ＇ｓ多重比較進行數據差異顯著性分析。

２結果與分析

２．１乙酸鈉對三角褐指藻生長及油脂積累的影響

試驗中發現該株三角褐指藻具有利用乙酸鈉進行兼養生長的能力，不同濃度乙酸鈉作為碳源對三角褐指藻比生長速率的影響如圖１所示。由圖１可知，添加不同濃度乙酸鈉后三角褐指藻的比生長速率均顯著高于對照（Ｐ＜０．０５），但添加不同濃度乙酸鈉各組之間無顯著差異（Ｐ＞０．０５）。在乙酸鈉濃度為１．０ ｇ／Ｌ時，三角褐指藻的比生長速率達到０．２２８ ｄ－１。

不同濃度乙酸鈉對三角褐指藻生物量和油脂含量的影響如圖２所示，當乙酸鈉濃度在１．０～５．０ ｇ／Ｌ時三角褐指藻的生物量均顯著高于對照（Ｐ＜０．０５）。當乙酸鈉濃度為５．０ ｇ／Ｌ時，采收到１．２８ ｇ／Ｌ的最大生物量，是對照（０．７６ ｇ／Ｌ）的１．７倍。添加不同濃度乙酸鈉后三角褐指藻油脂含量均顯著高于對照（Ｐ＜０．０５），當乙酸鈉濃度為０．５ ｇ／Ｌ時，三角褐指藻油脂含量達到最大（２８．９０％），是對照（１５．２２％）的１．９倍。

２．２尿素對三角褐指藻生長及油脂積累的影響

不同濃度尿素對三角褐指藻比生長速率的影響如圖３所示。由圖３可知，當尿素濃度在６０．１～２３４．２ ｍｇ／Ｌ時，三角褐指藻的比生長速率均顯著高于對照（Ｐ＜０．０５），但是添加不同濃度尿素各組之間無顯著差異（Ｐ＞０．０５）。當尿素濃度為４８０．５ ｍｇ／Ｌ時，顯著地抑制了三角褐指藻細胞的生長（Ｐ＜０．０５）。

不同濃度尿素對三角褐指藻生物量和油脂含量的影響如圖４所示。由圖４可知，雖然添加尿素的情況下三角褐指藻的生物量均高于對照，但是差異不顯著（Ｐ＞０．０５）。在不添加尿素條件下，三角褐指藻油脂含量可達２５．６５％，當尿素濃度在６０．１～４８０．５ ｍｇ／Ｌ時，其油脂含量隨著尿素濃度的增加而增加，但與對照相比，差異不顯著。

２．３Ｆｅ３＋對三角褐指藻生長及油脂積累的影響

不同濃度Ｆｅ３＋對三角褐指藻比生長速率的影響如圖５所示。由圖５可知，添加Ｆｅ３＋對三角褐指藻的生長沒有顯著促進作用（Ｐ＞０．０５）。當Ｆｅ３＋濃度為３４．７ ｍｇ／Ｌ時，反而對三角褐指藻細胞的生長有顯著抑制作用（Ｐ＜０．０５），說明Ｆｅ３＋濃度過高會抑制三角褐指藻的生長。

不同濃度Ｆｅ３＋對培養基中三角褐指藻生物量和油脂含量的影響如圖６所示。由圖６可知，在培養基中添加不同濃度的Ｆｅ３＋后，三角褐指藻的生物量與對照相比無顯著變化（Ｐ＞０．０５）。添加Ｆｅ３＋對三角褐指藻油脂含量的影響不顯著（Ｐ＞０．０５）。

３討論

本研究利用乙酸鈉作為碳源得到的三角褐指藻最大生物量是對照的１．７倍，劉曉娟等［６］在三角瓶中利用乙酸鈉靜置培養的三角褐指藻最大生物量是對照的１．２８倍，說明在培養基中適當添加碳源能夠明顯促進三角褐指藻細胞的生長和生物量的增加，兼養培養時微藻細胞同時吸收ＣＯ２和有機碳源，在光能和有機碳的協同作用下進行生長，光合作用和有機碳的氧化磷酸化是獨立進行的。Ｌｉｕ等［７］的研究表明添加有機碳源對呼吸作用的影響遠遠超過對光合作用的影響，表現為三角褐指藻的呼吸速率明顯增加，從而促進了碳代謝，有利于生物量的增加。試驗中發現添加不同濃度的乙酸鈉后三角褐指藻油脂含量均顯著高于對照（Ｐ＜０．０５），在乙酸鈉濃度為０．５ ｇ／Ｌ時獲得的最大油脂含量為２８．９０％，是對照的１．９倍。王海英等［８］的研究表明，同為添加碳源的兼養培養條件下的小球藻（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）在較低的光照下可以有效提高其油脂含量，達到對照組的１．５８倍，說明有機碳源的添加可以有效提高微藻細胞油脂的積累。

不同藻種對氮源的種類和濃度需求不同，本試驗在培養基中添加適當濃度的尿素顯著提高了三角褐指藻的比生長速率，但對生物量的提高差異不顯著（Ｐ＞０．０５），該培養基中尿素的添加與否對三角褐指藻油脂積累的影響較小（Ｐ＞０．０５）。本試驗在培養基中添加Ｆｅ３＋對三角褐指藻的生物量和油脂積累的影響差異不顯著，但夏金蘭等［４］發現三角褐指藻ＨＱＷ０２株系在含一定濃度的Ｆｅ３＋培養基中培養時呈最大生長速率，脂質含量是無Ｆｅ３＋培養時的２．８倍，這可能是藻種的差異造成的。

本試驗中采用的基礎培養基與培養硅藻常用的ｆ／２培養基相比，成分簡單、易于配制、成本較低。從本試驗的結果來看，培養基中不需要添加尿素與鐵鹽，添加合適濃度的乙酸鈉就可以有效增加三角褐指藻的生物量和油脂含量。該方法以簡單、快速、廉價的方式有效地提高了三角褐指藻的生物量和油脂積累。

參考文獻：

［１］ ＣＨＩＳＴＩ Ｙ． Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ，２００７，２５（３）：２９４－３０６．

［２］ 蔣漢明，高坤山． 氮源及其濃度對三角褐指藻生長和脂肪酸組成的影響［Ｊ］． 水生生物學報，２００４，２８（５）：５４５－５５１．

［３］ 王付冬，桑敏，李愛芬，等． 光照對眼點擬微綠球藻和三角褐指藻生長及總脂的影響［Ｊ］． 中國油脂，２０１０，３５（６）：７１－７５．

［４］ 夏金蘭，李麗，萬民熙，等． 兩株微藻的分離鑒定及Ｆｅ３＋對其生長和脂質積累的影響［Ｊ］．武漢大學學報（理學版），２０１０，５６（３）：３２５－３３０．

［５］ ＢＬＩＧＨ Ｅ Ｇ，ＤＹＥＲ Ｗ Ｊ． Ａ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９５９，３７（８）：９１１－９１７．

［６］ 劉曉娟，段舜山，李愛芬． 有機碳源對三角褐指藻生長、胞內物質和脂肪酸組分的影響［Ｊ］． 生物工程學報，２００８，２４（１）：１４７－１５２．

［７］ ＬＩＵ Ｘ Ｊ，ＤＵＡＮ Ｓ Ｓ，ＬＩ Ａ Ｆ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ， ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，２００９，２１（２）：２３９－２４６．

［８］ 王海英，郭祀遠，鄭必勝，等． Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ Ｖｕｌｇａｒｉｓ ｕｎｄｅｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ， ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｎｄ ｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．華南理工大學學報， ２００４， ３２（５）：４７－５８．

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文