柔嫩艾美耳球蟲敏感株與耐藥株成熟卵囊中葡萄糖含量的檢測

摘要：建立了一種采用比色測定中性糖的硫酸－酚法測定柔嫩艾美耳球蟲成熟卵囊中葡萄糖含量的方法，并對柔嫩艾美耳球蟲（Ｅｉｍｅｒｉａ．ｔｅｎｅｌｌａ）的敏感株和各種耐藥株共９個球蟲株的成熟卵囊中葡萄糖含量進行了測定。結(jié)果表明，敏感株成熟卵囊中的葡萄糖含量較低，而耐藥株成熟卵囊中葡萄糖含量則相對較高，二者比較呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性（Ｐ＜０．０１）。由此可見，柔嫩艾美耳球蟲對抗球蟲藥物的敏感性可能與成熟卵囊中葡萄糖含量有關(guān)，通過對成熟卵囊中葡萄糖含量的測定可作為判別柔嫩艾美耳球蟲是否耐藥的指標之一。

關(guān)鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲；敏感株；耐藥株；葡萄糖含量

中圖分類號：Ｓ８５２．７２＋３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）08－1647-03

Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｌｅｖｅｌ ｉｎ Ｍａｔｕｒｅ Ｏｏｃｙｓｔ of Ｄｒｕｇ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ or Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ Ｓｔｒａｉｎｓ

ＭＡ Ｌｉ－ｎｏｎｇ１，ＣＨＥＮ Ｚｈａｎｇ－ｌｉｕ２，ＹＵ Ｌｉａｎｇ－ｂｉｎ３

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ ５１８０５５，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ；

３． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕａｎｇｇａｎｇ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ，Ｈｕａｎｇｇａｎｇ ４３８０００，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｔｈｅ ｏｉｌ ｏｆ ｖｉｔｒｉｏｌ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｎｅｕｔｒａｌ ｓｕｇａｒｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｏｏｃｙｓｔ ｏｆ Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｏｏｃｙｓｔ ｏｆ ９ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔａｉｎｓ ｉｎ Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ （ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｔａｉｎ ａｎｄ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔａｉｎｓ）ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， tｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｏｏｃｙｓｔ of sensitive strain ｗａｓ ｌｏｗ； ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｏｏｃｙｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ｈｉｇｈ（Ｐ＜０．０１， ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）． Ｔｈｕｓ， ｔｈｅ ｓｔａｉｎｓ of Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ with ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ were ｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｏｏｃｙｓｔ． Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｏｏｃｙｓｔ could ｂｅ ｕｓｅｄ as one of the indicators to ａｎｔｉｃｏｃｃｉｄｉａｌ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ of Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄs： Eｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ； tｈｅ ｄｒｕｇ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎ； tｈｅ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ； tｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ

雞球蟲病是嚴重危害禽類生長發(fā)育，造成嚴重環(huán)境污染的一種疾病。集約化養(yǎng)雞場是球蟲病高發(fā)場所，目前防治雞球蟲病主要依賴于抗球蟲藥，但研究證實，雞球蟲幾乎對所有使用過的抗球蟲藥都產(chǎn)生了耐藥性。事實表明，任何一種抗球蟲藥在使用一定時間后，都會引起雞球蟲的耐藥性，隨著雞球蟲耐藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致抗球蟲藥使用的年限縮短，防治失敗或效果不佳，引起臨床或亞臨床球蟲病，造成很大的經(jīng)濟損失。耐藥性已成為雞球蟲病防治中最嚴重的問題之一［１］。尋找方便快捷檢測雞球蟲耐藥性的方法，有利于及時選用敏感藥物，及時停用耐藥性嚴重的藥物，對減少雞球蟲病造成的損失具有現(xiàn)實意義［２］。為此，筆者一直在尋找方便快捷的檢測雞球蟲耐藥性的方法，曾對柔嫩艾美耳球蟲敏感株和耐藥株的子孢子膜脂流動性進行過比較檢測，也對敏感株與抗藥株的ＡＴＰ酶活性進行過比較檢測［３，４］；本次試驗發(fā)現(xiàn)柔嫩艾美耳球蟲敏感株與耐藥株成熟卵囊中的葡萄糖含量存在顯著差異，似乎也可以作為判別柔嫩艾美耳球蟲是否對抗球蟲藥物產(chǎn)生耐藥性的檢測指標之一，且尚未見國內(nèi)的相關(guān)報道，現(xiàn)將試驗過程及結(jié)果報道如下。

１材料與方法

１．１材料

藥物：地克珠利，０．２％飲水劑，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗獸藥廠生產(chǎn)；百球清（甲基三嗪酮），２．５％飲水劑，德國拜耳公司（中國四川）生產(chǎn)；馬杜霉素銨鹽，９０．０％原粉，河南三寶（集團）中聯(lián)發(fā)酵廠生產(chǎn)；鹽霉素鈉鹽，１０％預(yù)混劑，廣州朝陽獸藥廠生產(chǎn)。以上藥物用于抗藥蟲株的實驗室誘導(dǎo)和野外分離株抗藥性的檢測。葡萄糖、甘露醇、硫酸等試劑均為分析純。

蟲株：以柔嫩艾美耳球蟲作為研究對象，用受試抗球蟲藥，運用不同的方法分別對敏感株（表１中編號１）進行試驗性誘導(dǎo)，最終形成表１中的２、３、６、９號誘導(dǎo)耐藥性蟲株，各抗藥蟲株的誘導(dǎo)方法將另文做詳細報道。對野外采集分離得到的蟲株進行上述４種抗球蟲藥物的耐藥性檢測，最終定出９株測試蟲株，其中敏感株１株，誘導(dǎo)耐藥株４株，野外耐藥株４株，并將各蟲株的編號、名稱及其主要特征歸納于表１。

主要儀器：水浴振蕩器，ＨＺＳ－Ｈ型，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；ＡＣＥ破碎乳化機（轉(zhuǎn)速１８ ０００ｒｐｍ），ＡＭ－６型，日本精機制作所；超聲波細胞破碎儀，５００ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司；島津ＵＶ－５００１分光光度計，日本島津株式會社；高速冷凍離心機，德國Ｈｅｔｔｉｃｈ公司。

１．２測定樣本的處理

１．２．１卵囊的繁殖與分離卵囊的繁殖采用１４日齡無球蟲感染的粵黃雞雛雞進行，分次收集雞盲腸中的卵囊進行分離純化，獲取純凈敏感株卵囊。具體胰蛋白酶消化法：將收集的盲腸及內(nèi)容物盡量剪碎后，置于ＡＣＥ破碎乳化機的盛杯中， １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ勻漿５ ｍｉｎ，將盲腸組織充分打碎，倒入燒杯中，用１ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至ｐＨ值８．０，加入０．５％～１．０％胰蛋白酶，在３９℃水浴條件下消化２０ ｍｉｎ，使卵囊完全分散游離出來，然后依次用２００、３００、４００、５００目篩過濾，濾液以３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄上清，反復(fù)洗滌幾次，充分洗去胰蛋白酶，向沉淀中加入適量的１．１ mol/L（比重為１．１２）蔗糖溶液，混勻，２ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，浮集于離心管上層的白色塞狀物即為卵囊，用小鐵絲網(wǎng)將卵囊撈于裝有０．５ mol/L蔗糖溶液的離心管中，２ ５００ ｒ／ｍｉｎ，離心１０ ｍｉｎ，反復(fù)３～４次，除去比重較小的雜質(zhì)，然后加入５％次氯酸鈉溶液，４℃下作用１０ ｍｉｎ，用清水離心洗去次氯酸鈉，最后將含有卵囊的清水以３ ０００ ｒ／ｍｉｎ，離心１０ ｍｉｎ，棄掉上清，沉淀即為純凈的未孢子化卵囊。將卵囊移入２．５％重鉻酸鉀液中，２８～３０℃下恒溫通氣培養(yǎng)２～３ ｄ，使卵囊孢子化，即為成熟卵囊。將孢子化成熟卵囊置于４℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

１．２．２成熟卵囊勻漿的制備將各蟲株孢子化成熟卵囊分別用雙蒸水通過多次離心的方法徹底洗凈后，移至０．２ ｍＬ塑料離心管中，經(jīng)多次高速離心１５ ０００ ｒ／ｍｉｎ，１０ ｍｉｎ，棄去上清，將各管的卵囊沉淀調(diào)至同一刻度后，分別置入２ ｍＬ塑料離心管中，用超聲波細胞破碎儀將成熟卵囊破碎至勻漿。邊破碎邊用光學(xué)顯微鏡觀察，待整個離心管中找不到完整的卵囊、孢子囊和子孢子，才停止破碎。然后將勻漿液高速離心１５ ０００ ｒ／ｍｉｎ，１０ ｍｉｎ，分離出上清至另一干凈離心管中，放入－２０℃冰柜中，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

１．２．３葡萄糖的測定方法參照方福德等［５］對葡萄糖的測定方法，采用的比色測定中性糖的硫酸－酚法。此方法是最為普通而簡單的中性糖檢測方法，能檢測５ μｇ／ｍＬ的葡萄糖含量。

１）葡萄糖標準曲線的測定。分別準確稱取３份葡萄糖，配制成５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０ μｇ／ｍＬ ７個不同濃度梯度，分別經(jīng)上述操作，用島津ＵＶ－５００１分光光度計進行比色測定。將４９０ ｎｍ處測得的葡萄糖吸光值（x）與相應(yīng)的葡萄糖濃度（）用直線回歸，求得標準曲線方程和相關(guān)系數(shù)。見表２和圖１。

２）樣品中葡萄糖含量的測定。將各樣品從－２０℃冰柜中取出，待其升至室溫后，分別將每一蟲株的孢子化卵囊勻漿上清液取０．５ ｍＬ于１．５ ｍＬ塑料離心管中，加入５００ ｍｇ／ｍＬ的三氯醋酸５０ μＬ沉淀蛋白質(zhì)，再經(jīng)１５ ０００ ｒ／ｍｉｎ高速離心１０ ｍｉｎ。吸取上清液０．３ ｍＬ于１０ ｍＬ玻璃離心管中，再分別加入０．５ ｍＬ ５％（W／V）酚的水溶液，在混旋器上充分混合后，直接向混合液的表面加入１．８ ｍＬ濃硫酸，立即在混旋器上，以較高轉(zhuǎn)速劇烈振搖３０ ｓ。然后，室溫放置３０ ｍｉｎ后，即可在島津ＵＶ－５００１分光光度計上進行比色測定，記錄每個樣品在４９０ ｎｍ處的吸光值。將其代入直線回歸方程中，求得不同蟲株孢子化卵囊的葡萄糖含量，列入表３，并做統(tǒng)計分析，將結(jié)果進行分析比較。

２結(jié)果與分析

２．１葡萄糖標準曲線的測定結(jié)果

根據(jù)表２中的批次１的方程，將測得的對應(yīng)濃度的葡萄糖吸光值繪制成標準曲線圖。見圖１。在葡萄糖比色測定中，其濃度在５～３２０ μｇ／ｍＬ范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。有資料顯示［６］，雞球蟲孢子化卵囊和子孢子中葡萄糖含量同樣高（３００ μｍｏｌ／Ｌ），同時還存在較高濃度的甘露醇（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ，即

１０ ０００ μｍｏｌ／Ｌ）。為了弄清甘露醇是否會對葡萄糖的測定有影響，試驗采用同樣的方法對甘露醇進行了測定，結(jié)果證明甘露醇用此法呈現(xiàn)無變色反應(yīng)。因此，用這一方法測定柔嫩艾美耳球蟲不同蟲株成熟卵囊中的葡萄糖含量時，可以排除甘露醇的干擾。

２．２敏感株與各種耐藥株孢子化成熟卵囊中葡萄糖含量的比較

經(jīng)過分別對９株參試蟲株柔嫩艾美耳球蟲敏感株和各種耐藥株孢子化成熟卵囊中葡萄糖含量的測定，并經(jīng)統(tǒng)計分析，結(jié)果見表３。從表３可見，敏感株孢子化成熟卵囊中的葡萄糖含量顯著低于各種耐藥株成熟卵囊中的葡萄糖含量，經(jīng)統(tǒng)計分析，耐藥株與敏感株差異極顯著（Ｐ＜０．０１），因此，敏感株與耐藥株成熟卵囊之間葡萄糖含量存在極顯著的差異。而在各耐藥株之間，無論是實驗室誘導(dǎo)耐藥株，還是野外耐藥株，它們之間成熟卵囊中的葡萄糖含量無顯著差異（Ｐ＞０．０５）。這一結(jié)果表明了柔嫩艾美耳球蟲成熟卵囊中的葡萄糖含量增高與耐藥性有著直接聯(lián)系，同時也為解釋敏感蟲株總是比耐藥蟲株容易喪失活力提供了一個理論依據(jù)。

３小結(jié)與討論

１）本文應(yīng)用紫外可見分光光度計，以葡萄糖試劑為對照品測定了９株柔嫩艾美耳球蟲敏感株與耐藥株成熟卵囊中的葡萄糖含量，方法簡便，結(jié)果可靠。

２）各球蟲耐藥株成熟卵囊中的葡萄糖含量與敏感株相比顯著增高，這可能與耐藥蟲株在對抗藥物作用時需消耗大量能量有關(guān)，換言之，球蟲敏感株的成熟卵囊中的葡萄糖含量較低，因而在對抗球蟲藥物作用時很容易被殺死。至于耐藥株的成熟卵囊中葡萄糖含量升高的機理還有待進一步探索。

３）對于柔嫩艾美耳球蟲卵囊中的葡萄糖含量有資料［６］顯示為３００ μｍｏｌ／Ｌ，當將其與本文劃為同一單位時，其含量僅只有０．３ μｍｏｌ／ｍＬ，但文獻中并未說明測定的方法，而用本方法測定的柔嫩艾美耳球蟲成熟卵囊中的葡萄糖含量遠比資料中顯示的要高，卻能區(qū)分柔嫩艾美耳球蟲敏感株和耐藥株成熟卵囊之間葡萄糖含量的差異。

４）葡萄糖是自然界分布最廣且最為重要的一種單糖，屬中性糖之一。葡萄糖在生物學(xué)領(lǐng)域具有重要地位，是所有動物生命活動中不可缺少的物質(zhì)，是所有活細胞的能量來源和新陳代謝中間產(chǎn)物。而對雞球蟲這類原生動物體內(nèi)的葡萄糖代謝的機理還知之甚少。

參考文獻：

［１］ 張會中，張潤輪．雞球蟲的耐藥性與應(yīng)對措施［Ｊ］ ．養(yǎng)禽與禽病防治，２０１０（３）：２６－３１．

［２］ 吉爾格力，李偉奇，何南生． 雞球蟲抗藥性的特點及其對策［Ｊ］．中國畜牧獸醫(yī)，２００９，３６（７）：１９１－１９３．

［３］ 馬立農(nóng)，陳杖榴． 柔嫩艾美耳球蟲敏感株和耐藥株子孢子膜脂流動性的檢測［Ｊ］． 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，２０１０，１９（８）：１６－２１．

［４］ 馬立農(nóng)，陳杖榴． 對柔嫩艾美耳球蟲敏感株與抗藥株ＡＴＰ酶活性的檢測［Ｊ］． 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，２００６，１５（４）：８９－９２．

［５］ 方福德，楊煥明，張德昌，等．分子生物學(xué)前沿技術(shù)［Ｍ］． 北京：北京醫(yī)科大學(xué) 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，１９９８．

［６］ 索勛，李國清． 雞球蟲病學(xué)［Ｍ］．北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，１９９８．