馬奶酒中抗單增李斯特氏菌細(xì)菌素產(chǎn)生菌的篩選及鑒定

摘要：從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品馬奶酒中分離出１４４株乳酸菌，通過雙層瓊脂平板擴(kuò)散法篩選出具有明顯抑菌作用的菌株。在排除有機(jī)酸、Ｈ２Ｏ２等的干擾后，其中１株乳酸菌的發(fā)酵上清液對受試的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用；進(jìn)一步硫酸銨沉淀、透析及濃縮處理后，其抑菌活性顯著增強(qiáng)，說明其代謝產(chǎn)物中含有蛋白質(zhì)類抑菌物質(zhì)，可能是細(xì)菌素。經(jīng)生理、生化試驗(yàn)和形態(tài)學(xué)觀察，將該菌株鑒定為屎腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃoｍ）。

關(guān)鍵詞：馬奶酒；乳酸菌；細(xì)菌素；篩選；鑒定

中圖分類號：Ｓ８７９．１；ＴＳ２０１．３文獻(xiàn)標(biāo)識碼： Ａ文章編號：0439－８114（２０11）08－1659-03

Screening for Anti-Listeria monocytogenes Bacteriocin-producing Lactic Acid

Bacteria from Koumiss

ＷＵ Ｊｉｎｇa，b，ＭＡＮＧ Ｌａｉa，ＨＥ Ｙｉｎ-ｆｅｎｇb

（a． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；b． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Inner Mongolia Agricultural University，Ｈｏｈｈｏｔ ０１００１８， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： １４４ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｋｏｕｍｉｓｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｏｒ ａｎｔｉ－Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ ａｇａｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ａｆｔｅｒ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｃａｔａｌａｓｅ， ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ ｏｎｅ ｓｔｒａｉｎ ｎａｍｅｄ ＭＫＢ６３ ｓｈｏｗｅｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔｉ－Ｌｉｓｔｅｒｉａ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ｂｙ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ． Ａｆｔｅｒ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ， ｄｉａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ； ｂｕｔ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｏｕｌｄ ｌｏｓｔ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍａｔｅｒｉａｌ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｈａｄ ｔｈｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ａｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｋｏｕｍｉｓｓ； ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ； ｓｃｒｅｅｎ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

馬奶酒是一種以鮮馬奶為原料，經(jīng)乳酸菌和酵母菌共同發(fā)酵而成的乳酸－酒精發(fā)酵乳飲料，它在我國草原游牧民族中有著悠久的歷史。能夠舒筋活血、驅(qū)寒通絡(luò)、排毒、消食健胃、促進(jìn)新陳代謝、增強(qiáng)肝脾功能和提高人體免疫力［１－３］。馬奶酒所具有的醫(yī)療保健作用與其所含有的微生物菌群有著密切的關(guān)系。

乳酸菌（Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ，ＬＡＢ）是一類能從可發(fā)酵碳水化合物（主要是指葡萄糖）中生產(chǎn)大量乳酸的細(xì)菌的通稱［４］，它們廣泛存在于人和禽畜的腸道、食品、物料及少數(shù)臨床樣品中。乳酸菌代謝能夠產(chǎn)生有機(jī)酸、過氧化氫、雙乙酰和細(xì)菌素等多種抗菌物質(zhì)。這些抗菌物質(zhì)通過抑制腐敗菌和病原菌的生長而防止腐敗，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥保健、飼料發(fā)酵及畜禽疾病防治等方面［５，６］。細(xì)菌素是在乳酸菌代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的，并分泌到環(huán)境中的一類對革蘭氏陽性菌具有抑制作用的殺菌蛋白或多肽，主要抑制同源的細(xì)菌，產(chǎn)細(xì)菌素菌株自身對細(xì)菌素具有免疫性 ［７，８］。同時(shí)，細(xì)菌素以其無毒性、對熱穩(wěn)定、易被人體消化道分泌的酶降解等特性，被公認(rèn)為是具有潛在開發(fā)能力的天然食品防腐劑和飼料添加劑［９，１０］。目前已被分離獲得并實(shí)際應(yīng)用的乳酸菌細(xì)菌素有雙球菌素、乳酸鏈球菌素、乳桿菌素等［１１］。

近年來，隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展及國際上對食品安全問題的日益關(guān)注，開發(fā)乳酸菌素作為新型的天然食品防腐劑、飼料添加劑和醫(yī)藥用劑已成為研究熱點(diǎn)。因此，篩選出具有高活性的細(xì)菌素產(chǎn)生菌株具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究以內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品馬奶酒為材料，分離篩選具有抑菌作用的乳酸菌，在種的水平上對其進(jìn)行鑒定，以期得到具有優(yōu)良特性的細(xì)菌素產(chǎn)生菌。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１馬奶酒內(nèi)蒙古地區(qū)牧民家庭中以傳統(tǒng)發(fā)酵法制作的馬奶酒樣品，樣品取回后于４℃貯藏備用。

１．１．２指示菌單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ＣＭＣＣ５４００２）由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

１．１．３試劑培養(yǎng)基：ＭＲＳ固體、液體培養(yǎng)基，胰酪蛋白胨液體培養(yǎng)基［１２，１３］，乳酸菌鑒定用系列培養(yǎng)基［１４］，分別依文獻(xiàn)介紹的方法配置。胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶Ｋ、溶菌酶，購于北京Ａｍｅｒｓｃｏ公司。

１．２方法

１．２．１乳酸菌的分離與培養(yǎng)將采集的２５種樣品各?。?ｇ左右加入到９ ｍＬ無菌生理鹽水試管中，連續(xù)１０倍遞增稀釋，?。保埃?、１０－５、１０－６稀釋度的混懸液１５０ μＬ，分別滴加到改良ＭＲＳ瓊脂培養(yǎng)基（含２．５％ ＣａＣＯ３）表面，用玻璃棒均勻涂抹，于３７℃培養(yǎng)４８ ｈ，觀察菌落形態(tài)是否有溶鈣圈。挑選有ＣａＣＯ３溶解圈的菌落劃線接種到改良ＭＲＳ瓊脂斜面。將４８ ｈ純培養(yǎng)菌落做革蘭氏染色，選取革蘭氏陽性、接觸酶陰性菌株菌，４℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

１．２．２乳酸菌上清液的制備用接種環(huán)挑取保存的乳酸菌接種于ＭＲＳ液體培養(yǎng)基中，３７℃ 靜置培養(yǎng)３６ ｈ，測定培養(yǎng)液的ｐＨ值，并取發(fā)酵液經(jīng)８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ（４℃），取上清液用０．４５ μｍ濾菌器過濾滅菌，得無細(xì)胞發(fā)酵上清液，冰箱４℃保存?zhèn)溆谩?/p>

１．２．３指示菌的活化培養(yǎng)及菌懸液的制備將保存的單核增生李斯特氏菌接入胰酪蛋白胨液體培養(yǎng)基，其余的指示菌均挑單菌落接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，３７℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)２０ ｈ后以２％的接種量再活化１代，用０．８５％無菌生理鹽水梯度稀釋，制成１０６ ＣＦＵ／ｍＬ菌懸液，冰箱中４℃保存待用。

１．２．４產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的篩選

１）抑菌試驗(yàn)方法。采用雙層瓊脂平板擴(kuò)散法檢測待檢菌發(fā)酵上清液中是否含有抑菌物質(zhì)。即在滅菌平皿內(nèi)倒入１０ ｍＬ ２％的滅菌水瓊脂，待瓊脂冷卻后放入滅菌的牛津杯中，將０．１ ｍＬ含菌約１０６ ＣＦＵ／ｍＬ的指示菌懸液加入到２０ ｍＬ ５０℃的指示菌培養(yǎng)基中，混合培養(yǎng)，倒入平皿中。培養(yǎng)基凝固后，用無菌鑷子取出牛津杯，加０．２ ｍＬ乳酸菌上清液，室溫?cái)U(kuò)散３～５ｈ，３７℃ 培養(yǎng)１２～１８ ｈ，設(shè)３個(gè)重復(fù)，以未接菌的ＭＲＳ液體培養(yǎng)基作對照，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑。選取抑菌活性高的菌株做復(fù)篩試驗(yàn)。

２）排除有機(jī)酸的干擾。用１．０ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液將發(fā)酵上清液調(diào)至ｐＨ值為６．０進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，以相同ｐＨ值的乳酸和乙酸作為對照，排除有機(jī)酸的干擾。

３）排除過氧化氫的影響。將發(fā)酵上清液在８０℃保溫１０ ｍｉｎ來排除過氧化氫的干擾，采用雙層瓊脂平板擴(kuò)散法檢測乳酸菌發(fā)酵上清液的抑菌活性。

１．２．５菌株產(chǎn)細(xì)菌素的鑒定

１）硫酸銨沉淀粗提。透析袋的處理方法：商品透析袋先用５０％乙醇煮沸１ ｈ，再依次用５０％ 乙醇、０．０１ ｍｏｌ／ｍＬ碳酸氫鈉和０．００１ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ溶液洗滌，最后用去離子水沖洗即可使用。

對上步篩選得到的菌株進(jìn)行產(chǎn)細(xì)菌素的鑒定試驗(yàn)。將硫酸銨粉末緩慢加入５０ ｍＬ離心上清液中，邊加邊攪拌，使最終飽和度為６０％，可看到有絮狀沉淀出現(xiàn)，置于４℃冰箱中靜置沉淀過夜，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，４℃冷凍離心２０ ｍｉｎ，將沉淀物按１∶１０比例溶解于滅菌去離子水中，做抑菌試驗(yàn)，同時(shí)以去離子水作為對照。然后將剩余的復(fù)溶液裝入３ ５００ Ｄａ的透析袋中脫鹽，用去離子水透析過夜，更換３次透析液，然后檢測鹽析上清液抑菌活性。

２）蛋白酶檢測抑菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)性質(zhì)。將不同蛋白酶配成５ ｍｇ／ｍＬ的溶液，各?。埃?ｍＬ于離心管中，分別無細(xì)胞上清液０．４ ｍＬ使酶的終濃度為１ ｍｇ／ｍＬ，其中胃蛋白酶和酸性蛋白酶發(fā)酵液的ｐＨ值調(diào)至２～３，其他蛋白酶發(fā)酵液的ｐＨ值均調(diào)至６～７（在其最適ｐＨ值范圍內(nèi)），同時(shí)以０．１ ｍＬ緩沖液加入０．４ ｍＬ細(xì)菌素液作為對照，３７℃溫育４ ｈ，然后以單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為指示菌，檢測抑菌活性。

１．２．６產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌菌株的鑒定將復(fù)篩得到的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)和生物學(xué)特性試驗(yàn)，參照文獻(xiàn)方法鑒定［１５］。

２結(jié)果與分析

２．１乳酸菌的分離和產(chǎn)抑菌物質(zhì)菌株的篩選

從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品馬奶酒中共分離出１４４株乳酸菌，其中球菌４５株，桿菌９９株。采用牛津杯雙層瓊脂法對單核增生李斯特氏菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，得到有抑菌活性的菌株８株。

乳酸菌在生長過程中代謝可以產(chǎn)生許多具有抑菌作用的物質(zhì)，如有機(jī)酸、細(xì)菌素、Ｈ２Ｏ２和雙乙酰等，均可分泌到上清液中起到抑制其他菌生長的作用，因此在篩選時(shí)就要排除這些干擾因素，確定是細(xì)菌素引起的抑菌作用。本研究將初篩菌株的發(fā)酵上清液用１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液中和ｐＨ值至６．０，再進(jìn)行對單核增生李斯特氏菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ＣＭＣＣ５４００２）抑菌試驗(yàn)，并設(shè)立ｐＨ值為６．０的乳酸和乙酸作對照。結(jié)果表明，ｐＨ 值為６．０的乳酸和乙酸對單核增生李斯特氏菌無抑制作用；在排除有機(jī)酸的干擾后和過氧化氫及菌體細(xì)胞的干擾試驗(yàn)后，受試菌中只有３株乳酸菌對單核增生李斯特氏菌仍然保持一定的抑菌活性，這說明發(fā)酵上清液中還有其他抑菌活性物質(zhì)的存在。其中有１株乳酸菌對單核增生李斯特氏菌表現(xiàn)出較好的抑菌作用，因此選定ＭＫＢ６３作為下一步試驗(yàn)的測試菌。

２．２菌株產(chǎn)細(xì)菌素的鑒定

２．２．１硫酸銨沉淀粗提硫酸銨通常用于蛋白質(zhì)的鹽析，一般細(xì)菌素在６０％飽和度時(shí)即大部分沉淀。透析袋處理通常用于蛋白質(zhì)的脫鹽，可以使小分子鹽類物質(zhì)（有機(jī)酸等）滲出袋外，從而達(dá)到純化蛋白的目的。本試驗(yàn)對篩選得到的１株細(xì)菌素產(chǎn)生菌的發(fā)酵上清液進(jìn)行硫酸銨鹽析和透析處理，發(fā)現(xiàn)抑菌活性仍然存在，而且抑菌活性顯著增強(qiáng)。其抑菌試驗(yàn)結(jié)果見圖１。

２．２．２蛋白酶敏感性取少許胃蛋白酶、溶菌酶、胰蛋白酶和蛋白酶Ｋ酶溶液與發(fā)酵上清液混合，使酶濃度為０．５ ｍｇ／ｍＬ，于３７ ℃酶解４ ｈ，進(jìn)行牛津杯抑菌試驗(yàn)，結(jié)果見表２。從表２可以看出，受試的１株菌所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)對蛋白酶表現(xiàn)出不同的敏感性，但是它們在經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，均完全失去抑菌活性，基本可以推測，該抑菌活性物質(zhì)為一類蛋白質(zhì)類。

２．３菌株的鑒定

菌株分離純化后，革蘭氏染色陽性，細(xì)胞呈球形或卵圓形，一般以雙球狀或鏈狀排列，菌體大小為（０．６～２．０）μｍ×（０．６～２．５）μｍ，不生芽孢，兼性厭氧。在ＭＲＳ固體培養(yǎng)基上３７℃培養(yǎng)２４ ｈ后，形成圓形光滑、乳白色、不透明的小菌落。乳酸菌的菌體形態(tài)如圖２所示。

菌株ＭＫＢ６３的生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表３所示。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》，分離到的球菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，均產(chǎn)生Ｌ－乳酸。１０℃和４５℃生長，并生長于ｐＨ值為９．６的６．５％ ＮａＣｌ中，可還原０．１％美蘭牛乳，鑒定為Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ屬的細(xì)菌。菌株具有耐熱性，發(fā)酵甘露醇、蜜二糖，不發(fā)酵棉子糖、山梨醇，基本符合文獻(xiàn)資料中屎腸球菌的特征，初步確定為屎腸球菌（Ｅnterococcus ｆａｅｃoｍ）。

３結(jié)論

從傳統(tǒng)馬奶酒中分離出１４４株乳酸菌，其中有３株乳酸菌對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌具有較強(qiáng)的抑制作用，通過對該菌株發(fā)酵上清液中有機(jī)酸和過氧化物的排除試驗(yàn)和蛋白酶敏感性試驗(yàn)，得到產(chǎn)細(xì)菌素較高的ＭＫＢ６３菌株。經(jīng)常規(guī)生理生化試驗(yàn)和形態(tài)學(xué)觀察，初步鑒定為屎腸球菌，這將為我國乳酸菌細(xì)菌素的開發(fā)與利用提供豐富的資源。課題組將進(jìn)一步研究該細(xì)菌素的生物學(xué)特性及安全性，為其在食品保鮮防腐方面的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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