紫球藻抗菌蛋白的純化及其部分性質(zhì)研究

摘要：紫球藻提取液經(jīng)硫酸銨沉淀、ＨＡ柱層析后分離純化出１種抗菌蛋白。經(jīng)ＳＤＳ－ＰＡＧＥ測定，2個(gè)亞基的相對(duì)分子量為２１.0 ｋＤ與３０.0 ｋＤ；此抗菌蛋白對(duì)熱敏感，氨基酸組成分析顯示含有１７種氨基酸，含量較高的是谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸。純化的蛋白對(duì)產(chǎn)黃青霉有較強(qiáng)抑制作用，其抗真菌活性比抗細(xì)菌活性強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：紫球藻；抗菌蛋白；純化；性質(zhì)

中圖分類號(hào)：Ｑ９４９．２９＋２．１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）08－~1587-03

Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Some Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ

Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｃｒｕｅｎｔｕｍ

ＣＨＥＮ Ｘｉａｏ－ｑｉｎｇ１，ＺＨＥＮＧ Ｙｉ２，ＬＩＮ Ｘｉｏｎｇ－ｐｉｎｇ３

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ ３６３０００，Ｆｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｆｕｊｉａｎ Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｆｕｊｉａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｉｔｙ， Ｆｕｚｈｏｕ ３５0108，Ｃｈｉｎａ； ３． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎｉｎｇｄｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｎｉｎｇｄｅ ３５２１００， Ｆｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｎ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｃｒｕｅｎｔｕｍ ｂｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎ ＨＡ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｐｐｅａｒｅｄ ｔｗｏ ｂａｎｄｓ ｗｉｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ２１ｋＤ ａｎｄ ３０ｋＤ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｈａｎｇｅ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄs， ａｍｏｎｇ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｇｌｕ， Ｇｌｙ ａｎｄ Ａｓｐ ｗａｓ ｈｉｇｈ respectively． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ． Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｃｒｕｅｎｔｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｃｒｕｅｎｔｕｍ； ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ

植物含有豐富的抗菌蛋白，有數(shù)百種之多，如蘿卜［１］、尾穗莧［２］、銀杏［３］和葫蘆種子［４］中的抗菌蛋白以及幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶抑制劑、核糖體失活蛋白等［５］，它們都有不同程度的抑菌作用。Ｍｅｌｏ等［６］報(bào)道沙菜（紅藻類）的粗蛋白具有抗真菌作用及從墨角藻中提取的類凝集素能抑制大腸桿菌和腦膜炎雙球菌生長；陳國強(qiáng)等［７］研究發(fā)現(xiàn)，３種大型海藻的粗蛋白對(duì)６種植物病原真菌的菌絲生長及孢子萌發(fā)具有不同程度的抑制效果，但目前對(duì)微藻抗菌蛋白的研究報(bào)道較少。

紫球藻（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｃｒｕｅｎｔｕｍ）是一種比較原始的單細(xì)胞紅藻，具有獨(dú)特的物理特征，在生長過程中能合成多種有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生物活性物質(zhì)。前期的研究發(fā)現(xiàn)紫球藻的蛋白質(zhì)提取物具有抗菌活性［８］。本試驗(yàn)對(duì)此抗菌蛋白進(jìn)行了分離純化，并測定了其部分性質(zhì)，為進(jìn)一步開展微藻資源的研究提供參考。

１材料和方法

１．１材料

試驗(yàn)藻種為紫球藻，引自中國科學(xué)院水生生物研究所，以ＫＯＣＨ培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)光照強(qiáng)度為３ ０００ μｍｏｌ／（ｍ２·ｓ），光周期為１２ ｈ光照／１２ ｈ黑暗，培養(yǎng)溫度為２５～３０℃，取對(duì)數(shù)期（培養(yǎng)１０ ｄ后）的培養(yǎng)物，離心洗滌，收集藻泥，４℃保存?zhèn)溆?。菌種來自福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（６種細(xì)菌）和福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院（６種真菌）。

１．２方法

１．２．１抗菌蛋白質(zhì)的分離純化將紫球藻泥懸浮于ｐＨ值為６．８的１０ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸緩沖液（ＰＢＳ）中，反復(fù)凍融，結(jié)合超聲波破碎，離心，取上清液，加入硫酸銨至飽和度為５５％，充分?jǐn)噭?，置４℃冰箱保存１２ｈ后離心，收集沉淀并溶于少量的ＰＢＳ中，透析，離心，獲上清液，即為紫球藻蛋白提取物，檢測抗菌活性，獲得抗菌蛋白粗品，４℃保存。

將適量濃縮后的抗菌蛋白粗提液上羥基磷灰石（ＨＡ）柱層析，用ｐＨ值為６．８的１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ預(yù)平衡ＨＡ（１．８ｃｍ×３０ｃｍ層析柱），上樣量２ ｍＬ，以離子強(qiáng)度不斷增加的ＰＢＳ（分別為１、５、５０、１００、２００ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值為６．８并加入０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）洗脫，洗脫速度為２０ ｍＬ／ｈ，樣品４ ｍＬ／管，分部收集洗脫液，測定２８０ ｎｍ的吸光度（Ａ），待Ａ２８０＜０．０１時(shí)換洗脫液。以考馬斯亮藍(lán)染色法（ＣＢＢ－Ｇ２５０）測定蛋白質(zhì)濃度，用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（ＰＡＧＥ）測定純度，在室溫下用日立Ｕ－３４００紫外分光光度計(jì)測定其吸收光譜［９］。

１．２．２測定蛋白質(zhì)亞基分子量參考Ｌａｅｍｍｌｉ的方法［１０］，采用十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）測定蛋白質(zhì)亞基分子量，分離膠濃度為１２％，濃縮膠濃度為３．９％。

１．２．３氨基酸組成分析取純品１ ｍｇ，加入６ ｍｏｌ／Ｌ鹽酸，至安瓿瓶中１２０℃水解６ ｈ，用去離子水反復(fù)沖洗去除鹽酸，采用日立８３５－５０型氨基酸自動(dòng)分析儀測定氨基酸組成。

１．２．４抑菌活性的測定純化后的蛋白質(zhì)，配制成１０ ｍｇ／ｍＬ的溶液，參照文獻(xiàn)［１１］，采用圓形紙片法測定其抑菌活性，觀察結(jié)果并測量抑菌圈直徑的大小。各個(gè)步驟均按無菌條件操作，每個(gè)樣品設(shè)２個(gè)平行樣，取平均值。

１．２．５熱穩(wěn)定性分析純化的抗菌蛋白質(zhì)（１０ ｍｇ／ｍＬ）分別置于５０～１００℃處理３０ ｍｉｎ，每１０℃ １個(gè)溫差，以最敏感菌為指示菌，測定其抑菌活性。

２結(jié)果與分析

２．１抗菌蛋白的分離純化

紫球藻蛋白提取液以ＨＡ柱層析，在洗脫過程中，隨磷酸鹽離子濃度的提高而逐漸出現(xiàn)一個(gè)鮮艷的粉紅色洗脫峰（圖１），收集此洗脫部分并透析濃縮，以產(chǎn)黃青霉為指示菌進(jìn)行檢測，具有抗菌活性，即為收集的抗菌蛋白。

用紫外分光光度計(jì)測定此抗菌蛋白吸收光譜，在５４５ｎｍ有特征性吸收峰。以抗菌蛋白溶液在最大可見光吸收峰波長的吸光度與蛋白質(zhì)的特征吸收值之比來表示純度，可得Ａ５４５／Ａ２８２＝５．２３。抗菌蛋白電泳（ＰＡＧＥ）得到１條帶，說明經(jīng)過１次ＨＡ柱層析即可得到純化的蛋白。

２．２抗菌蛋白的性質(zhì)

２．２．１亞基分子量紫球藻抗菌蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ顯示出2條帶（圖２），表明是由２個(gè)亞基組成，通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)遷移率（Ｒｆ）比較，它們的分子量為２１.0 ｋＤ與３０.0 ｋＤ。

２．２．２氨基酸組成氨基酸測定結(jié)果見表１，可知除色氨酸全部被破壞未測出以外，紫球藻抗菌蛋白含有１７種氨基酸，其中，谷氨酸含量最高，其次為天冬氨酸與甘氨酸含量，組氨酸與胱氨酸含量最少。

２．２．３抑菌活性從表２可以看出，純化的紫球藻抗菌蛋白對(duì)６種真菌和４種細(xì)菌有抑制活性。對(duì)產(chǎn)黃青霉的抑制活性最為明顯，對(duì)細(xì)菌的抑制不如對(duì)真菌的抑制作用強(qiáng)。紫球藻抗菌蛋白對(duì)各個(gè)真菌的抑制活性并不完全相同，這也與許多報(bào)道的抗菌蛋白性質(zhì)相一致。

２．２．４熱穩(wěn)定性以產(chǎn)黃青霉為指示菌做抑菌試驗(yàn)，紫球藻抗菌蛋白在５０℃處理３０ ｍｉｎ后仍有抗菌活性，在６０℃處理３０ ｍｉｎ后抗菌活性消失，說明此抗菌蛋白對(duì)溫度較為敏感。

３討論

國內(nèi)外研究人員已進(jìn)行了大量關(guān)于植物抗真菌蛋白的研究，并從７０多種植物中發(fā)現(xiàn)了１７０余種具抗真菌功能的蛋白，這些蛋白對(duì)多種植物病原菌有抑制作用，是植物防御體系的重要組成部分［１２］。本試驗(yàn)所得蛋白質(zhì)對(duì)供試的動(dòng)植物病原菌有一定的抑制作用，對(duì)溫度變化較為敏感，這與海水小球藻抗菌蛋白對(duì)熱較為穩(wěn)定不同［１３］。

目前，對(duì)植物病蟲害的防治，主要采用化學(xué)合成的殺菌劑，但由于化學(xué)合成的農(nóng)藥毒性大，在自然界難以降解，致使生態(tài)環(huán)境受到嚴(yán)重的破壞。利用生物產(chǎn)生的天然活性物質(zhì)直接作為殺菌劑或以其新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)作先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化開發(fā)合成的類似物，已日益受到重視［１４］。本試驗(yàn)中所獲得的抗菌蛋白具有廣譜抗動(dòng)植物病原菌的活性，因此，有必要深入探討其抑菌作用的內(nèi)在分子機(jī)制，為抗菌蛋白的研究建立基礎(chǔ)［５］。

自２０世紀(jì)６０年代以來，國內(nèi)外許多學(xué)者圍繞紫球藻的分類、生態(tài)營養(yǎng)、培養(yǎng)及應(yīng)用等方面進(jìn)行了研究，取得了良好進(jìn)展，但對(duì)其蛋白質(zhì)生物活性的研究較少。因此，本研究可為今后進(jìn)一步開發(fā)利用紫球藻提供有用的參考資料。

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