干旱脅迫對(duì)小麥幼苗過(guò)氧化物酶同工酶的影響

摘要：以河南廣泛種植的４個(gè)小麥品種幼苗為材料，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，研究了經(jīng)干旱處理后，４種小麥幼苗根和葉的過(guò)氧化物酶同工酶譜及酶活性的變化。結(jié)果表明，４種小麥根和葉過(guò)氧化物酶同工酶酶帶分為Ａ區(qū)、Ｂ區(qū)、Ｃ區(qū)。在干旱脅迫下，酶帶數(shù)目增加，且Ａ、Ｂ、Ｃ ３個(gè)區(qū)酶帶均有不同程度的加深。干旱脅迫后，４個(gè)品種小麥幼苗根和葉中ＰＯＤ活性顯著增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：干旱脅迫；小麥；過(guò)氧化物同工酶

中圖分類(lèi)號(hào)：Ｓ５１２．１；Ｑ９４５．７８文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）08－1530-03

Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｄｒｏｕｇｈｔ Ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ ｏｆ Ｗｈｅａｔ Ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ

ＰＥＩ Ｄｏｎｇ－ｌｉ１，２

（１． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ－Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ／Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｈａｎｇｑｉｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｑｉｕ ４７６００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ， Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｗｈｅａｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｔｈａｔ ｗｉｄｅｌｙ ａｄｏｐｔｅｄ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｎａｎ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｒｏｕｇｈｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ＰＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｓｏｚｙｍｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＰＡＧＥ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＰＯＤ ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ ｂａｎｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔs ａｎｄ leaves ｏｆ ｆｏｕｒ ｗｈｅａｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｒｅｇｉｏｎ Ａ， ｒｅｇｉｏｎ Ｂ ａｎｄ ｒｅｇｉｏｎ Ｃ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｄｒｏｕｇｈｔ ｓｔｒｅｓｓ， ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ＰＯＤ ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ ｂａｎｄｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｂａｎｄｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｅｄ． Ａｆｔｅｒ ｄｒｏｕｇｈｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ＰＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙs ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｗere ｈｉｇｈｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｄｒｏｕｇｈｔ ｓｔｒｅｓｓ； ｗｈｅａｔ； ＰＯＤ ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ

隨著溫室效應(yīng)的進(jìn)一步加劇，干旱已成為影響全球農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量的最大因素。我國(guó)作為糧食生產(chǎn)大國(guó)，干旱問(wèn)題亟須引起我們的注意。近年來(lái)的研究表明，近幾十年內(nèi)中國(guó)的干旱事件仍將較為頻繁，特別是在中國(guó)北方地區(qū)，干旱化趨勢(shì)仍將繼續(xù)［１］。因此，研究干旱狀態(tài)下的植物尤其是小麥、玉米等重要農(nóng)作物的生理變化具有重要意義。

目前，小麥抗旱機(jī)制的研究主要集中在形態(tài)結(jié)構(gòu)方面，包括根系構(gòu)型、結(jié)構(gòu)及葉片形態(tài)；生理機(jī)制方面，包括光合作用、滲透調(diào)節(jié)、酶及蛋白質(zhì)含量；分子生物學(xué)等方面［２］。

同工酶是生物體內(nèi)的一種重要的蛋白質(zhì)，與生物體的遺傳、生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)及抗性生理都有著重要關(guān)系，主要包括過(guò)氧化物酶（ＰＯＤ）、淀粉酶（ＡＭＹＺ）、乙醇脫氫酶（ＡＤＨ）、蘋(píng)果酸脫氫酶（ＭＤＨ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、酯酶（ＥＳＴ）、過(guò)氧化氫酶（ＣＡＴ）等。ＰＯＤ與植物的抗逆性有關(guān)，是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶之一［３］，普遍存在于植物各種組織器官中，具有物種組織器官和發(fā)育階段的特異性［４］。它對(duì)環(huán)境變化十分敏感，如輻射、重金屬、低溫、鹽脅迫、干旱脅迫等逆境下都會(huì)引起酶譜帶及活性的變化。

試驗(yàn)以河南廣泛種植的煙輻１８８、濮麥９號(hào)、新麥１８、周麥１８ ４個(gè)小麥品種為材料，對(duì)小麥幼苗在干旱脅迫下ＰＯＤ同工酶譜及酶活性的變化進(jìn)行分析，旨在探究其變化規(guī)律，同時(shí)比較不同組織器官對(duì)逆境反應(yīng)的差異，以期為小麥抗旱生理研究提供一定的參考依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

選取河南省廣泛種植的具有代表性的４個(gè)小麥品種，分別是煙輻１８８、濮麥９號(hào)、新麥１８、周麥１８。

１．２方法

１．２．１材料的培養(yǎng)與處理４個(gè)小麥品種，各選取５０粒成熟飽滿的種子，用０．１％的氯化汞（ＨｇＣｌ２）消毒處理１０ ｍｉｎ，流水沖洗１０ ｍｉｎ，２５℃催芽２４ ｈ后，將萌發(fā)一致的種子播種于裝有石英砂的花盆中，置于溫室中培養(yǎng)，溫度（２８±２）℃／（２０±２）℃，相對(duì)濕度８０％。每天澆灌１／２ Ｈａｏｇｌａｎｄ營(yíng)養(yǎng)液，幼苗生長(zhǎng)至一葉一心期（約１０ ｄ），將幼苗分為正常對(duì)照組和持續(xù)干旱組。持續(xù)干旱組小麥停止給其加營(yíng)養(yǎng)液，５ ｄ后分別對(duì)兩個(gè)組小麥的根、葉進(jìn)行取樣分析。每處理３次重復(fù)。

１．２．２ＰＯＤ同工酶活性測(cè)定小麥幼苗根和葉各稱(chēng)取０．５ ｇ，加入２ ｍＬ ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ值７．８， 內(nèi)含０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ和１％ ＰＶＰ），冰浴研磨至勻漿，再加入緩沖液沖洗２～３次，并使最終體積為５ ｍＬ， 勻漿液于４℃下１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ冷凍離心１０ ｍｉｎ，取出上清液，即為酶提取液，用于ＰＯＤ活性測(cè)定和ＰＯＤ同工酶電泳。

酶活性的測(cè)定反應(yīng)體系為： ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ值 ７．８的磷酸緩沖液５０ｍＬ，３０％ Ｈ２Ｏ２ ０．０２８ ｍＬ，０．２％愈創(chuàng)木酚０．０１９ ｍＬ。取３ ｍＬ反應(yīng)混合液，加入０．１ ｍＬ酶液，于室溫２５℃反應(yīng)３ ｍｉｎ。在４７０ ｎｍ下讀數(shù)，每隔１ ｍｉｎ讀取一次，共記取４次數(shù)據(jù)，然后取平均值，規(guī)定以每分鐘ＯＤ470ｎｍ變化０．０１為一個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位。用下面的公式計(jì)算［５］：酶活性Ｕ＝ΔＯＤ470ｎｍ×Ｄ／０．０１Ｗ×ｔ。ΔＯＤ470ｎｍ為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化值；Ｗ為植物鮮重； ｔ為反應(yīng)時(shí)間（１ ｍｉｎ），Ｄ為稀釋倍數(shù)，酶活單位為Ｕ／（ｇＦＷ·ｍｉｎ）。

１．２．３ＰＯＤ同工酶電泳ＰＯＤ同工酶電泳采用北京六一垂直板電泳槽進(jìn)行。采用１０％的分離膠，４％的濃縮膠，點(diǎn)樣量３０ μＬ，在濃縮膠中穩(wěn)定電壓為９０Ｖ，進(jìn)入分離膠后穩(wěn)定電壓為２００Ｖ，３～４ ｈ完成電泳。同工酶電泳的染色采用醋酸－聯(lián)苯胺法染色（０．１ ｇ聯(lián)苯胺＋０．９ ｍＬ冰醋酸＋ｄＨ２Ｏ ９７．１ ｍＬ＋３％ Ｈ２Ｏ２ ２．０ ｍＬ），室溫下染色１～５ ｍｉｎ，看到酶帶顯藍(lán)色，即取出放入流水中沖洗過(guò)夜，酶帶漸變成亮棕色。

２結(jié)果與分析

２．１干旱脅迫對(duì)小麥幼苗ＰＯＤ同工酶酶譜的影響

根據(jù)４個(gè)小麥品種的ＰＯＤ同工酶電泳圖譜結(jié)果，為了更加直觀、清晰地對(duì)比和分析，繪制電泳圖譜示意圖如圖１。根據(jù)ＰＯＤ酶帶的集中程度和遷移率的大小，可將酶譜帶區(qū)分為Ａ區(qū)、Ｂ區(qū)、Ｃ區(qū)。從圖1中可知，Ａ區(qū)酶帶中，干旱處理后４個(gè)小麥品種幼苗根和葉酶帶的染色均有不同程度的加深，濮麥９號(hào)和周麥１８處理后葉的酶帶數(shù)新增了一條。Ｂ區(qū)酶帶中，干旱處理后濮麥９號(hào)根和葉、新麥１８葉和周麥１８根和葉的ＰＯＤ酶帶數(shù)都有不同程度增加，并且染色加深。Ｃ區(qū)酶帶中，在原來(lái)的無(wú)帶區(qū)，干旱處理后，新增加了１條酶帶，并且染色較深，而酶帶數(shù)目沒(méi)有變化的品種則染色加深。

２．２干旱脅迫對(duì)小麥幼苗ＰＯＤ同工酶活性的影響

４個(gè)小麥品種幼苗干旱處理后根和葉中ＰＯＤ同工酶活性變化情況見(jiàn)圖２。由圖２可知，經(jīng)干旱處理后，４個(gè)品種小麥幼苗根和葉中ＰＯＤ活性均有較大程度的增強(qiáng)，甚至是成倍地增加。各品種小麥幼苗干旱處理前和處理后，根部的ＰＯＤ活性均高于葉中ＰＯＤ活性。

３討論

４個(gè)小麥品種幼苗干旱處理后ＰＯＤ酶譜呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律。譜帶的變化主要表現(xiàn)在脅迫后譜帶數(shù)目的變化（增加）和譜帶染色程度的變化（加深），這與以前的研究結(jié)果相似［６］。譜帶染色程度的加深比較普遍，不僅體現(xiàn)在各區(qū)上，而且經(jīng)干旱脅迫后４個(gè)小麥品種無(wú)論是根還是葉中，均有程度明顯的加深。原因可能是干旱脅迫激活了一些與ＰＯＤ基因相結(jié)合的反式作用因子，使其易于結(jié)合到順式作用元件上或使它們結(jié)合得更牢固；或者是干旱脅迫激活了某些抗終止子，使原本應(yīng)該停止轉(zhuǎn)錄的ＰＯＤ基因繼續(xù)表達(dá)；也可能是通過(guò)這兩個(gè)途徑的協(xié)同作用使ＰＯＤ含量增加而表現(xiàn)為染色加深。具體分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

植物在正常的生理?xiàng)l件下，體內(nèi)的氧自由基處于低水平的動(dòng)態(tài)平衡中。但在逆境（如干旱）條件下自由基的含量增加使動(dòng)態(tài)平衡受到破壞，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，細(xì)胞器甚至整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)都會(huì)受到破壞。一般認(rèn)為，ＰＯＤ、ＳＯＤ、ＣＡＴ是植物酶促反應(yīng)體系的保護(hù)酶，它們協(xié)同作用，防御活性氧對(duì)細(xì)胞的傷害，以減輕干旱脅迫對(duì)植物的傷害。研究結(jié)果表明，經(jīng)干旱處理后，小麥幼苗根和葉中的ＰＯＤ活性顯著增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)了ＰＯＤ的生理功能。在活性氧代謝過(guò)程中，ＰＯＤ發(fā)揮了重要作用，在細(xì)胞中ＰＯＤ可催化ＮＡＤＨ或ＮＡＤＰＨ氧化成O ，進(jìn)一步被歧化為Ｈ2Ｏ2和分子氧。Ｈ2Ｏ2是一種相對(duì)穩(wěn)定的分子，在ＰＯＤ或ＣＡＴ催化下轉(zhuǎn)變成對(duì)細(xì)胞無(wú)害的Ｈ2Ｏ和Ｏ2。ＰＯＤ是生物體的一種重要的抗氧化酶，ＰＯＤ活性增強(qiáng)可緩解干旱脅迫造成的氧化性損傷，減輕對(duì)細(xì)胞膜的破壞，這是生物體的一種適應(yīng)性反應(yīng)。

小麥幼苗在受到干旱脅迫時(shí)，ＰＯＤ同工酶酶帶和酶活性都發(fā)生了顯著的變化。酶活性的變化是符合自由基傷害學(xué)說(shuō)的，體現(xiàn)了ＰＯＤ作為一種保護(hù)酶的功能。酶帶的變化比較復(fù)雜，研究其分子機(jī)理對(duì)提高小麥的抗旱性，進(jìn)一步篩選小麥抗旱品系有一定的指導(dǎo)意義。關(guān)于干旱脅迫下小麥幼苗根部與葉片中其他抗氧化同工酶（ＳＯＤ、ＣＡＴ）的變化還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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［６］ 徐興友，王子華，張風(fēng)娟，等．干旱脅迫對(duì)６種野生耐旱花卉幼苗根系保護(hù)酶活性及脂質(zhì)過(guò)氧化作用的影響［Ｊ］．林業(yè)科學(xué)，２００８，４４（２）：４１－４７．