褪黑素對SAP大鼠腎損傷的保護作用及機制研究

[摘要] 目的 探討外源性褪黑素對重癥急性胰腺炎（SAP）相關腎臟損傷的保護作用及機制。方法 雄性SD大鼠90只隨機分為正常對照組（N組）、SAP并腎損害組（S組）、褪黑素干預組（M組）。光鏡下觀察胰腺、腎組織病理改變，對腎組織病理損害評分；檢測各組大鼠血清淀粉酶（AMY）、肌酐（Cr）、丙二醛（MDA）含量及腎細胞凋亡指數。評估褪黑素對SAP并腎臟損傷的保護作用與脂質過氧化、腎細胞凋亡的相關性。結果 S組隨造模時間延長病理損傷逐步加重，M組相同時間點腎臟病理損害均較S組減輕（P＜0.05）；與S組比較，M組相同時間點血清AMY、Cr、MDA含量及腎細胞凋亡指數均降低（P＜0.05）；S組及M組中MDA與血清Cr、腎細胞凋亡指數均呈正相關（P＜0.05）。結論 褪黑素對SAP相關腎臟損傷有保護作用，其機制可能是通過抗脂質過氧化，抑制腎臟細胞凋亡來實現。

[關鍵詞] 褪黑素；重癥急性胰腺炎；腎臟損傷；脂質過氧化；凋亡

[中圖分類號] R692 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）35-05-02

Protective Effect and Mechanism of Melatonin on Acute Severe Pancreatitis Associated with Renal Injury in Rats

LIU Yi1 ZHOU Zhengduan2 DENG Mingming1

1.Department of Gastroenterology，Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China；2.The Fourth People's Hospital of Zigong City，Zigong 643000，China

[Abstract] Objective To investigate the protective effect and related mechanisms of exogenous melatonin on severe acute pancreatitis（SAP）associated with renal injury in rats. Methods Ninety SD rats were equally divided into three groups randomly：normal control group（group N），SAP associated with renal injury group（group S） and melatonin intervention group（group M），whose pathologic changes of kidney were observed and graded under microscope；Then the level of serum amylase（AMY），creatinine（Cr），malondialdehyde（MDA） and the apoptosis index of renal cell in rats were measured. Finally，the correlation among protective effect of melatonin on renal injury in SAP，lipid peroxidation and renal cell apoptosis were assessed. Results The pathological lesion in group S was gradually aggravated with extension of molding time；The renal pathological lesion in group M at the same time point was more remissive than that in group S（P＜0.05）. Compared with group S at the same time point，the expression level of serum AMY，Cr，MDA and apoptosis index in group M were decreased（P＜0.05）. In group S and M，the expression level of MDA were positively correlated with Cr and apoptosis index respectively（P＜0.05）. Conclusion The effects of melatonin has a protective function on renal injury in SAP，its mechanism exerts of this effect may depend on anti-lipid peroxidation and decreasing renal cell apoptosis in kidney.

[Key words] Melatonin；Severe acute pancreatitis；Renal damage；Lipid peroxidation；Apoptosis

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是臨床常見危重癥，常并發(fā)腎功能衰竭導致患者死亡，防治腎功損害能有效縮短SAP病程及降低其死亡率[1]。褪黑素（melatonin，MT）是一種強效自由基清除劑，國內外近期研究認為褪黑素能降低SAP模型大鼠肝細胞及肺組織損害[2，3]，本實驗擬通過建立SAP大鼠腎損傷模型及褪黑素干預模型，研究褪黑素對SAP相關腎臟損傷的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

雄性SD大鼠90只，體重200～250g，購自瀘州醫(yī)學院動物房；褪黑素、牛磺膽酸鈉購自Sigma公司；細胞凋亡原位檢測（TUNEL）試劑盒購自武漢博士德公司；MDA測試盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立模型 將90只大鼠隨機分為對照組（N組）、SAP并腎損害組（S組）、MT干預組（M組）各30只。術前12h禁食、自由飲水。S組動物模型參照牛磺膽酸鈉逆行性胰膽管內加壓注射法[4]建立，按（1mL/kg）將4%牛磺膽酸鈉逆行勻速推注至胰管中（0.2mL/min）；N組開腹后僅翻動胰腺，恢復原狀后關腹；M組術后10min將MT液注射于大鼠背部皮下（50mg/kg）。術后各組正常進食、飲水，12h、24h、48h各處死10只。

1.2.2 血清學指標檢測 將處死大鼠開胸后心臟穿刺采血3～5mL，室溫靜置30min，高速離心20min，收集血清，-20℃保存，全自動生化分析儀測定各組大鼠血清淀粉酶（Amy）、肌酐（Cr）含量；硫代巴比妥法測定丙二醛（MDA）含量。

1.2.3 病理學檢測 處死大鼠胰腺及腎組織用10%甲醛固定、石蠟切片、HE染色，光鏡下觀察其病理學改變。參考雷文章等[5]標準對腎組織病理損害評分。

1.2.4 腎組織細胞凋亡指數檢測 各組大鼠腎組織石蠟切片采用TUNEL法檢測細胞凋亡指數，光鏡觀察腎臟凋亡細胞，胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，于陽性表達分布區(qū)域、每片光鏡（10×40）視野下隨機選擇5個無重疊視野，計數陽性細胞，以凋亡陽性細胞數占總細胞數的百分比作為細胞凋亡指數。

1.3 統計學處理

使用SPSS14.0軟件進行統計學分析。計量資料用均數±標準差（χ±s）表示，組間比較用單因素方差分析，相關性用多元線性回歸分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺、腎組織病理學變化

光鏡下觀察：N組各時點胰腺、腎組織結構完整。S組造模后12h胰腺小葉內和小葉外周局灶性壞死，間質內炎細胞浸潤，腎小球毛細血管瘀血；24h時胰腺腺泡極度腫脹、出血，可見片狀壞死；腎組織可見散在壞死、蛋白管型，間質大量炎細胞浸潤；48h時胰腺多處片狀壞死，部分腺葉正常結構消失，腎小球囊內可見嗜伊紅染色的絮狀物和紅細胞，腎小管內亦可見嗜伊紅染色的均質管型或紅細胞管型，小部分大鼠腎小管上皮細胞呈片狀壞死。M組各時間點腎臟病理改變均較SAP組減輕，病理評分見表1。

2.2 血清學指標分析

S、M組大鼠血清淀粉酶（AMY）、肌酐（Cr）、MDA值隨造模時間延長逐漸上升。S組（12h、24h、48h）與N組同時間點AMY、Cr、MDA值比較顯著升高（P＜0.01），M組（12h、24h、48h）與S組同時間比較明顯降低（P＜0.05）。見表1。

2.3 凋亡指數的變化

見表2。

2.4 相關性分析

S組中MDA含量與血清Cr、腎細胞凋亡指數均呈正相關（r分別為0.807，0.607，P＜0.05），M組中MDA含量與血清Cr、腎細胞凋亡指數均呈正相關（r分別為0.826，0.721，P＜0.05）。

3 討論

胰源性腎功能障礙是導致SAP患者死亡的重要因素之一，發(fā)展至急性腎衰后病死率可達80%[6]，其機制尚未完全明確。本實驗中，模型大鼠胰腺及腎組織間質炎細胞浸潤、出血、壞死，后期組織結構不清且程度隨時間延長逐漸加重；S組各時段腎組織病理損害評分及血清AMY、Cr值明顯高于N組（P＜0.05）。

MDA是脂質過氧化作用的最終分解產物，其變化可以反映脂質過氧化程度。本實驗研究發(fā)現隨SAP大鼠造模時間延長，S組MDA含量逐漸增多，明顯高于同時段N組（P＜0.01）；通過相關性分析發(fā)現血清Cr值與MDA含量呈正相關（P＜0.05），說明脂質過氧化對SAP時腎臟功能的損害是存在的。細胞凋亡是由生理或病理因素引起的細胞程序性死亡方式，是機體維持自身穩(wěn)定的一種基本生理機制。本實驗研究發(fā)現S組腎臟細胞凋亡指數隨造模時間延長逐漸升高，明顯高于N組同時間段指標（P＜0.01）；且S、M組中腎細胞凋亡指數與MDA均呈正相關（P＜0.05），說明SAP發(fā)展中脂質過氧化與腎臟細胞凋亡存在密切關系。脂質過氧化介導細胞凋亡的機制目前尚未完全清楚，可能與脂質過氧化引起細胞內Ca2+釋放增加、GSH的耗盡等因素有關，Ca2+能激活促使細胞凋亡的各個信號轉導途徑。

褪黑素是松果體腺分泌的一種吲哚類激素，能有效清除氧自由基，通過調節(jié)細胞因子抑制炎癥發(fā)生發(fā)展[7]，其受體廣泛存在于免疫器官、大腦、甲狀腺、胃腸道、腎臟、胰腺B細胞。近年來，國外部分研究[8，9]認為褪黑素能影響胰腺組織脂質過氧化程度，修復炎癥后胰腺組織。本實驗中M組大鼠各項檢測指標與S組同時段相比較：腎臟病理損傷減輕（P＜0.05）；血清AMY、Cr、MDA下降（P＜0.05）；腎細胞凋亡指數降低（P＜0.05）。說明褪黑素在SAP疾病發(fā)展中具有抗氧化的功能，并可能通過抗脂質過氧化、抑制細胞凋亡從而達到改善腎臟功能的作用，其抗氧化機制不明，可能與其結構穩(wěn)定、能增強抗氧化酶活力及基因表達、產生具有強大自由基清除效能的代謝產物等因素相關。

綜上所述，脂質過氧化引起細胞凋亡對SAP時腎損害的影響不容忽視。褪黑素所具有的高效抗氧化性是谷胱甘肽的4倍，維生素E的2倍[10]，而且它具有脂溶性和水溶性雙重性質，極易透過各種生理屏障到達體內任何部位發(fā)揮藥理作用。如能在SAP早期應用褪黑素，無疑對干預炎癥發(fā)生進展和防治腎功損害具有積極作用。

[參考文獻]

[1] 劉寶，潘愛軍，邵敏，等．重癥急性胰腺炎早期并發(fā)多臟器功能障礙綜合征的危險因素分析[J]．中華急診醫(yī)學雜志，2006，15（2）：110.

[2] Col C，Dinler K，Hasdemir O，et al．Exogenous melatonin treatment reduces hepatocyte damage in rats with experimental acute pancreatitis[J].Hepatobiliary Pancreat Sci，2010，17：682-687．

[3] 董樂妹．褪黑素干預急性壞死性胰腺炎肺損害及巨噬細胞移動抑制因子表達[J]．中國臨床藥理學與治療學，2009，14（3）：261-264．

[4] 楊元生，崔淑蘭，陳墾，等．重癥急性胰腺炎實驗動物模型的研究進展[J]. 世界華人消化雜志，2009，17（25）：2601-2606．

[5] 雷文章，韋靖江，沈文律，等．實驗性壞死性胰腺炎多器官損害與內毒素血癥的關系[J]．中華實驗外科雜志，1995，12（3）：131-132．

[6] Pupelis G．Renal failure in acute pancreatitis. Timing of dialysis and surgery[J]．przegl Lek，2000，57（suppl 5）：29-31.

[7] Gulben K，Ozdemir H，Berberoglu U，et al．Melatonin modulates the severity of taurocholate—induced acute pancreatitis in the rat[J]．Dig Dis Sci，2010，55：941-946．

[8] Col C，Dinler K，Hasdemir O，et al．Oxidative stress and lipid peroxidation products：effect of pinealectomy or exogenous melatonin injections on biomarkers of tissue damage during acute pancreatitis[J]．Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2010，9：78-82．

[9] Sidhu S，Pandhi P，Malhotra S，et al．Melatonin treatment is beneficlal in pancreatic repair process after experimental acute pancreatitis[J]. Eur J Pharmacol，2010，628（1/3）：282-289．

[10] Jaworek J，Konturek SJ，Toraaszewska R，et a1．The circadian rhythm of melatonin modulates the severity of caerulein—induced pancreatitis in the rat[J]．J Pineal Res，2004，37（3）：161-170.

（收稿日期：2011-09-26）