Skp2、P27 和CyclinE在宮頸癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

[摘要] 目的 探討宮頸浸潤(rùn)癌組織中Skp2、p27和CyclinE的表達(dá)及相關(guān)性，以及與臨床病理因素和預(yù)后的關(guān)系。 方法 采用免疫組化二步法檢測(cè)70例宮頸癌中Skp2、p27和CyclinE的表達(dá)，并分析三者的表達(dá)與宮頸癌臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系，同時(shí)探討三者在宮頸癌中表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果 ①Skp2和CyclinE在宮頸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為57.1%和64.3%，并隨著腫瘤分化程度的降低表達(dá)增高（P＜0.05），與浸潤(rùn)深度、脈管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.05），與年齡、臨床分期、癌灶大小無(wú)關(guān)（P＞0.05）。兩者的高表達(dá)5年生存期明顯低于其低表達(dá)（P＜0.05）。P27在宮頸癌中的陽(yáng)性表達(dá)情況與以上兩者相反。②Skp2、CyclinE和P27呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；Skp2和CyclinE呈正相關(guān)（P＜0.01）。 結(jié)論 Skp2和CyclinE蛋白高表達(dá)可能是宮頸組織惡變的重要生物學(xué)標(biāo)志，Skp2、CyclinE高表達(dá)，伴P27低表達(dá)提示腫瘤的高侵襲性及不良預(yù)后。

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌；Skp2蛋白；P27蛋白；CyclinE蛋白；免疫組化

[中圖分類號(hào)] R737.25 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2011）35-01-04

Expressions of Skp2，P27 and CyclinE Proteins and Their Correlations with Clinicopathological Features of Invasive Cervical Carcinoma

WU Honglian1 LV Jieqiang2

1.Department of Obstetrics and Gynecology， Wenzhou Medical Affiliated the Sixth Hospital Lishui City People's Hospital，Lishui 323000，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology， Wenzhou Medical Affiliated the Second Hospital，Wenzhou 325027，China

[Abstract] Objective To learn the expression of Skp2，p27 and CyclinE in the lesions of invasive cervical carcinoma（ICC），and their relationships with the clinicopathological features and prognosis of this certain disease. Methods Expressions of Skp2，p27 and CyclinE were measured by immunohistochemical technique in 70 cases invasive cervical carcinoma.In addition，the relationship of Skp2，p27 and CyclinE expression with clinicopathological features and prognosis of ICC was then analyzed. Results ①The Skp2 and CyclinE positively expressed rate in ICC was 57.1% and 64.3%.The expression increased as the tumor differentiation decreasing. The expression of Skp2 and CyclinE had strong correlation with the tumor infltrating depth，intravascular involvement and lymph node metastasis（P＜0.05），while no obvious relationship with age，clinical stage or tumor size（P＞0.05）. The 5-year survival rate of ICC in positive Skp2 and CyclinE higher expressed group was remarkably lower than those of lower expressed group，which indicated a strong relationship of Skp2 and CyclinE expression with cervical carcinoma prognosis（P＜0.05）. The P27 expression in cervical carcinoma in the opposite situation with the Skp2 and CyclinE. ②The interrelation of Skp2，P27 and CyclinE protein expressed in ICC：the Skp2 and CyclinE expression in cervical carcinoma had negative correlation with P27 expression（P＜0.01）. There was strongly positive relation between Skp2 and CyclinE expression in ICC（P＜0.01）. Conclusion Over expression of Skp2 and CyclinE along with low expression of P27 may indicate higher invasive tendency of tumor and poor prognosis.

[Key words] Invasive cervical carcinoma；Skp2 protein；P27 protein；CyclinE protein；Immunohistochemistry

宮頸癌是我國(guó)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅婦女健康。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限制生長(zhǎng)，從而引起腫瘤。有關(guān)Skp2、P27和CyclinE在腫瘤中的表達(dá)已有研究報(bào)道，但聯(lián)合檢測(cè)三者在宮頸癌中的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在探討細(xì)胞周期調(diào)控因子Skp2、P27和CyclinE在宮頸癌中的表達(dá)，及與臨床病理因素間的關(guān)系及兩兩間的關(guān)系。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選取我院2002年1月～2005年1月病理科確診并存檔的手術(shù)切除宮頸鱗癌石蠟包埋組70例，具有完整的臨床、病理及隨訪資料。所有病例均為初治者，術(shù)前均未接受放射治療或化學(xué)治療。其中年齡35～67歲，平均年齡47.5歲，＜45歲31例，≥45歲39例。按病理學(xué)分級(jí)：≤Ⅱ級(jí)29例，Ⅲ級(jí)41例。按FIGO標(biāo)準(zhǔn)分期：Ⅰa期16例，Ⅰb期17例，Ⅱa期17例，Ⅱb期20例。局部癌灶大小：＜4cm 38例，≥4cm 32例。根據(jù)術(shù)后病理肌層浸潤(rùn)程度：≤淺肌層28例，＞淺肌層42例；伴脈管浸潤(rùn) 29例，無(wú)脈管浸潤(rùn) 41例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者51例。另選取50例正常宮頸組織作為對(duì)照。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用免疫組織化學(xué)二步法分別檢測(cè)標(biāo)本中Skp2、P27和CyclinE的表達(dá)，以購(gòu)買的陽(yáng)性片免疫組化染色結(jié)果為陽(yáng)性對(duì)照。以PBS 替代第一抗體的免疫組化染色結(jié)果為陰性對(duì)照。

1.3 試劑

濃縮型鼠抗Skp2單克隆抗體、即用型P27鼠抗單克隆抗體、CyclinE鼠抗單克隆抗體、SP免疫組化染色超敏試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)公司。

1.4實(shí)驗(yàn)步驟

按說(shuō)明書(shū)操作，石蠟切片經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟→梯度酒精脫水→抗原修復(fù)→檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)→過(guò)氧化物酶阻斷溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶→封閉非特異性抗原→加一抗→過(guò)夜→二抗→三抗（鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶溶液）→DAB染色→蘇木素復(fù)染→脫水、透明→封片。

1.5 結(jié)果判斷

免疫組化切片在光鏡下按統(tǒng)一放大倍數(shù)（×400倍），以組織切片中細(xì)胞核染為棕褐色或棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)志。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Skp2、CyclinE在ICC、CIN及NCE中的表達(dá)

Skp2、CyclinE 的陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞核。在低分化ICC細(xì)胞核中呈強(qiáng)陽(yáng)性，在CIN中呈陽(yáng)性或弱陽(yáng)性，在NCE中呈陰性，偶見(jiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖1A、B、D。從NCE→CIN→ICC，Skp2和CyclinE蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，見(jiàn)表1。ICC中Skp2和CyclinE表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、間質(zhì)浸潤(rùn)、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤(rùn)顯著相關(guān)，兩者的陽(yáng)性表達(dá)率顯著增高，見(jiàn)表2。Skp2和CyclinE蛋白陽(yáng)性表達(dá)組的5年生存率明顯低于其陰性表達(dá)組（P＜0.05），見(jiàn)圖2、圖4。

2.2 P27在ICC、CIN及NCE中的表達(dá)

在NCE組中P27陽(yáng)性表達(dá)多數(shù)位于表層分化完畢的細(xì)胞核中，胞漿弱表達(dá)，見(jiàn)圖1C，而在ICC組中胞核呈陽(yáng)性表達(dá)，胞漿弱表達(dá)。從ICC→CIN→NCE，P27陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，見(jiàn)表1。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性、脈管浸潤(rùn)陽(yáng)性及間質(zhì)浸潤(rùn)（＞淺肌層）中，P27陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低，見(jiàn)表2。P27蛋白陽(yáng)性表達(dá)組的5年生存率明顯高于其陰性表達(dá)組（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

2.3 宮頸癌中Skp2、P27及CyclinE的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)隨訪資料，Skp2和CyclinE高表達(dá)、P27低表達(dá)者5年生存期明顯低于Skp2和CyclinE低表達(dá)、P27高表達(dá)者，兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)比較有顯著性差異（P＜0.05）。見(jiàn)表3。Skp2和CyclinE表達(dá)陰性、P27表達(dá)陽(yáng)性患者預(yù)后明顯優(yōu)于Skp2和CyclinE表達(dá)陽(yáng)性、P27表達(dá)陰性者，見(jiàn)圖2～4。

2.4 ICC中Skp2、P27及CyclinE表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，ICC中Skp2與P27蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.458，P＜0.01）。Skp2與CyclinE蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.763，P＜0.01）。P27與CyclinE蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.504，P＜0.01）。

3 討論

3.1 Skp2在宮頸癌中的表達(dá)及意義

Skp2是Zhang等[1]于1995年從大量的惡變細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種能與S期激酶cyclinA-CDK2相互作用的蛋白，故命名為Skp2（S-phase kinase-associated proteins）。何春年[2]等研究顯示：Skp2 在NCE中表達(dá)很低，在CINⅠ中表達(dá)明顯增高。大量研究表明，Skp2在多種惡性實(shí)體腫瘤中常呈高表達(dá)，且提示預(yù)后不良。本研究中，我們檢測(cè)到Skp2在ICC中陽(yáng)性表達(dá)率為57.1%，與Dowen等研究結(jié)果相似。Skp2在ICC中的陽(yáng)性表達(dá)率高于CIN及NCE，在CIN中的陽(yáng)性表達(dá)率也高于NCE，表明Skp2高表達(dá)與宮頸癌密切相關(guān)，可能與Skp2泛素化降解P27，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限制通過(guò)G1/S期轉(zhuǎn)換“關(guān)卡”，無(wú)限制的分裂增殖，形成惡性克隆，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[3]。為進(jìn)一步探討Skp2在宮頸癌發(fā)展進(jìn)程中的作用，我們分析了Skp2蛋白的表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，Skp2的陽(yáng)性表達(dá)率與臨床分期、患者年齡及癌灶大小無(wú)明顯關(guān)系，而與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、間質(zhì)浸潤(rùn)深度和脈管浸潤(rùn)顯著相關(guān)，以上提示Skp2的高表達(dá)使得腫瘤具有更強(qiáng)的侵襲性。另外從本研究中還發(fā)現(xiàn)Skp2高表達(dá)者5年生存期明顯低于Skp2低表達(dá)者，且Skp2陰性表達(dá)組的預(yù)后明顯優(yōu)于陽(yáng)性表達(dá)組，以上均提示Skp2陽(yáng)性表達(dá)或高表達(dá)者，癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲性，且預(yù)后差。

3.2 P27在宮頸癌中的表達(dá)及意義

P27作為細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，廣泛抑制各種細(xì)胞周期蛋白和激酶的活性，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。在人類幾乎所有的上皮性腫瘤中都有P27蛋白表達(dá)的下降或缺失，且隨惡性程度的增加其表達(dá)呈下降趨勢(shì)。在乳腺癌、食管癌、前列腺癌[4]等研究證實(shí)：P27蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)、生存期明顯相關(guān)。本研究中P27蛋白在ICC→CIN→NCE的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，與Skomedal等[5]在宮頸癌的研究結(jié)果相似，表明P27是宮頸癌的抑制因素，宮頸癌中P27的下調(diào)消除了對(duì)細(xì)胞周期的抑制，使細(xì)胞無(wú)限制的增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。腫瘤的分化程度影響腫瘤的預(yù)后，本研究顯示P27的表達(dá)隨著腫瘤分化程度降低，陽(yáng)性表達(dá)率逐漸下降，提示P27與腫瘤的生物學(xué)惡性行為有關(guān)。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，P27的陽(yáng)性表達(dá)率與臨床分期、患者年齡及腫瘤大小無(wú)明顯關(guān)系，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、間質(zhì)浸潤(rùn)深度和脈管浸潤(rùn)顯著相關(guān)，其陽(yáng)性表達(dá)率顯著下降，可能與P27的下調(diào)降低細(xì)胞間的粘附能力，使腫瘤易于發(fā)生轉(zhuǎn)移。另外從本研究中還發(fā)現(xiàn)P27低表達(dá)者5年生存期明顯低于P27高表達(dá)者，并且P27陽(yáng)性表達(dá)組預(yù)后明顯優(yōu)于陰性表達(dá)組，以上提示P27低表達(dá)或表達(dá)缺失與腫瘤的發(fā)生、惡性進(jìn)展相關(guān)，并提示預(yù)后不良。

3.3 CyclinE在宮頸癌中的表達(dá)及意義

CyclinE是細(xì)胞周期G1期的正性調(diào)控因子，其過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞由Gl期進(jìn)入S期，使正常細(xì)胞增殖失控導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，已被證實(shí)是一種癌基因。有學(xué)者在乳腺癌，胃癌[6]中均發(fā)現(xiàn)CyclinE基因的擴(kuò)增出現(xiàn)在細(xì)胞癌變的早期。本研究中我們發(fā)現(xiàn)CyclinE在宮頸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于CIN及NCE，在CIN中的陽(yáng)性表達(dá)率也高于NCE，由此推斷CyclinE過(guò)表達(dá)參與ICC的發(fā)生及惡性進(jìn)展。本研究中分析了CyclinE蛋白的表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系，結(jié)果顯示與Skp2蛋白表達(dá)相似，并隨腫瘤組織學(xué)分化程度降低，其陽(yáng)性表達(dá)率也呈現(xiàn)增高趨勢(shì)。另外從本研究中還發(fā)現(xiàn)CyclinE高表達(dá)5年生存期明顯低于CyclinE低表達(dá)，并且預(yù)后差。以上表明CyclinE的過(guò)度陽(yáng)性表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能是影響宮頸癌分化、進(jìn)展及淋巴結(jié)浸潤(rùn)機(jī)制的重要因素之一，并提示預(yù)后不良，其原因可能是CyclinE過(guò)度表達(dá)促使細(xì)胞通過(guò)Gl期進(jìn)入S期，使細(xì)胞過(guò)度增殖失控而致腫瘤形成。

3.4 Skp2、P27和CyclinE在宮頸癌中表達(dá)的相互關(guān)系

本研究在ICC中顯示：Skp2與P27蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Skp2與CyclinE蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，p27 與CyclinE蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。隨著宮頸癌分化程度降低，Skp2、CyclinE的表達(dá)逐漸增高，而P27的表達(dá)逐漸降低。近年來(lái)，人們已經(jīng)在人類多種實(shí)體惡性腫瘤如淋巴瘤中、卵巢腫瘤[7]中發(fā)現(xiàn)Skp2與P27之間呈負(fù)相關(guān)。Skp2是新發(fā)現(xiàn)的SCF多功能E3酶復(fù)合體中的一種F-box蛋白，通過(guò)泛素蛋白酶體途徑降解P27，下調(diào)P27的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、異常分裂，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。

CyclinE是一種癌基因，主要在G1晚期發(fā)揮正性調(diào)控作用，通過(guò)與CDK結(jié)合，使CDK活化，促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化。P27是一種細(xì)胞周期抑止劑，主要通過(guò)與cyclinE-CDK2的結(jié)合，抑制CDK的活性而發(fā)揮抑癌作用，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期而停滯于G1期，如二者失調(diào)將導(dǎo)致細(xì)胞增殖和惡變，提示它們之間可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。已有研究證實(shí)[8]，多種實(shí)體腫瘤中P27表達(dá)下調(diào)和CyclinE過(guò)度表達(dá)，可能是通過(guò)共同途徑參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并認(rèn)為聯(lián)合兩者的檢測(cè)，有益于指導(dǎo)臨床輔助治療及篩選不良預(yù)后。

研究發(fā)現(xiàn)，CyclinE在多種腫瘤中有基因擴(kuò)增及過(guò)表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，并且已經(jīng)被證實(shí)是一種癌基因。而Skp2由于在不同癌癥細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)和在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室中被證實(shí)的致癌活性而被確定為癌基因。本研究提示，兩者在宮頸癌中高表達(dá)可能起協(xié)同促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，并提示預(yù)后不良，其作用機(jī)制目前尚不明確，可能與P27表達(dá)下調(diào)相關(guān)，有待于進(jìn)一步研究明確。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)Skp2、P27和CyclinE在宮頸癌中的表達(dá)，提示Skp2、CyclinE的高表達(dá)和P27的低表達(dá)或表達(dá)缺失可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)判斷宮頸癌的惡性傾向和評(píng)估預(yù)后具有重要的參考價(jià)值，為臨床上進(jìn)一步了解宮頸癌的生物學(xué)行為、判斷預(yù)后、指導(dǎo)術(shù)后臨床輔助治療提供幫助。

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（收稿日期：2011-10-09）