亞硝酸鹽對聚磷菌厭氧代謝的影響

摘 要：以2種強化生物除磷（EBPR）系統中的活性污泥為研究對象，考察亞硝酸鹽對聚磷菌厭氧代謝的影響，結果表明：不同EBPR系統中的聚磷菌對于亞硝酸鹽的耐受能力不同。人工配水富集聚磷菌的活性污泥，當亞硝態氮濃度超過10 mg/L時，聚磷菌吸收VFA受到抑制， PHA的合成減少，磷酸鹽的釋放增加；處理生活污水的SBR短程脫氮除磷活性污泥，亞硝酸鹽的濃度高達30 mg/L時，未對聚磷菌的厭氧代謝造成抑制，但引起異養反硝化菌與聚磷菌競爭VFA，導致PHA合成量和釋磷量的減少。富集聚磷菌的活性污泥投加亞硝酸鹽后P/VFA增大，說明有亞硝酸鹽存在時更多的能量用于VFA的吸收。對2種活性污泥中聚磷菌的熒光原位雜交（FISH）定量分析表明：富集聚磷菌系統中聚磷菌含量達到55%，而短程脫氮除磷系統中為7.6%。

關鍵詞：聚磷菌；亞硝酸鹽；厭氧代謝；抑制；污水處理

中圖分類號：X703.1 文獻標志碼：A 文章編號：1674-4764（2012）02-0132-06

Effect of Nitrite on Anaerobic Metabolism of Phosphate

Accumulating Organisms

ZENG Wei， YANG Ying-ying， WANG Xiang-dong， LI Lei， LI Bo-xiao， PENG Yong-zhen

(School of Environmental and Energy Engineering， Beijing University of Technology， Beijing 100124， P. R. China)

Abstract:Two enhanced biological phosphorus removal (EBPR) sludges were used to investigate the effect of nitrite on anaerobic metabolism of phosphate accumulating organisms (PAOs). It is found that tolerance of PAOs to nitrite in two sludges were different. In the sludge with enriched PAOs cultures treating synthetic wastewater， when nitrite is above 10 mg/L， it inhibits VFA-uptake of PAOs， leading to decrease of PHA synthesis and increase of phosphate release. In the sludge with nitrogen and phosphorus removal by shortcut nitrification treating real domestic wastewater， anaerobic metabolism of PAOs is not inhibited even when nitrite is 30 mg/L; however， the presence of nitrite in anaerobic period causes denitrifying bacteria compete for limited carbon sources with PAOs， resulting in decrease of PHA synthesis and phosphate release. For the enriched PAOs cultures， the ratio of P/VFA obviously increases when nitrite is added in the reactor， indicating increased energy requirement for PAOs to take up VFA. The quantification results for PAOs in two sludges using fluorescence in-situ hybridization (FISH) show that the PAOs level is 55% in the enriched PAOs cultures， and 7.6% in the sludge with nitrogen and phosphorus removal by shortcut nitrification.

Key words:phosphate accumulating organisms (PAOs); nitrite; anaerobic metabolism; inhibition; wastewater disposal

強化生物除磷(Enhanced biological phosphorus removal， EBPR)作為一種經濟可持續的除磷工藝在污水處理廠中得到了廣泛的應用。EBPR工藝的實現主要依靠聚磷菌(Phosphate accumulation organisms， PAOs)在交替的厭氧/好氧環境中放磷及過量吸磷，然后通過排放剩余污泥達到除磷的目的。厭氧條件下，PAOs體內的多聚磷酸鹽(polyphosphate， poly-P)分解，產生的能量用于揮發性脂肪酸(volatile fatty acids， VFAs)的吸收， 并以聚羥基烷酸(poly-β-hydroxyalkanoates， PHA)的形式儲存于細胞內。PHA合成所需的還原力由糖原的分解供給。好氧條件下，PAOs分解體內儲存的PHA，獲得的能量用于細胞的生長、糖原的補充和磷的過量吸收及儲存［1］。

亞硝酸鹽作為硝化和反硝化過程的中間產物，廣泛存在于生活污水脫氮除磷系統中，并在一定條件下形成積累，含量甚至能夠達到19 mg/L以上［2-3］。有報道指出在污水生物處理系統中，高濃度的亞硝酸鹽對多種微生物產生抑制作用，包括普通需氧型異養菌和硝化細菌等［4-6］。近年，亞硝酸鹽對PAOs好氧吸磷和反硝化吸磷的抑制引起了學者的廣泛關注。Zhou等［7］以4種不同的污泥為研究對象，考察了亞硝酸鹽對PAOs反硝化吸磷過程的影響，發現亞硝的游離態形式——游離亞硝FNA(Free nitrous acid， FNA)才是真正的抑制劑，當FNA濃度達到0.02 mg HNO2-N/L時，吸磷作用則被完全抑制。當FNA從0.002 mg HNO2-N/L增加到0.02 mg HNO2-N/L時，聚磷菌的反硝化速率減小了約40%。Weon 等［8］人以Acinetobacter sp為對象，研究了亞硝酸鹽對聚磷菌好氧代謝的影響，指出Acinetobacter sp 的好氧生長和吸磷過程都受到了亞硝酸鹽的抑制。Pijuan等［9］進一步提出了FNA是真正的抑制劑，對好氧條件下Accumulibacter PAO 的生長、糖原的合成以及吸磷都造成嚴重的抑制。可見，亞硝酸鹽的存在對于EBPR系統的穩定運行有著重要的影響。

目前，亞硝酸鹽對PAOs代謝影響的研究多集中于反硝化吸磷和好氧吸磷過程，而亞硝酸鹽對PAOs厭氧代謝影響的研究較少。本研究以來自不同的EBPR系統的活性污泥為研究對象，在厭氧條件下投加一定量的亞硝酸鹽，分析亞硝酸鹽對PAOs厭氧代謝的影響機制，有利于進一步了解亞硝酸鹽對生物除磷過程的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗污泥和反應器運行

試驗所用污泥取自2個不同的EBPR系統。

活性污泥1：取自實驗室SBR 1反應器，該反應器采用厭氧/好氧運行方式富集聚磷菌，進水為人工合成廢水。有效容積10 L，每天運行2周期，每周期290 min（厭氧120 min，好氧160 min，沉淀排水10 min），排水比1：4。通過調節流量計維持溶解氧在2.0±0.5 mg/L之間。用1M HCL和1M NaOH調節pH，維持厭氧進水初始pH=7.5，好氧段pH在7.3~7.6之間。

活性污泥2：取自實驗室SBR 2反應器，以厭氧/好氧方式運行，進水為實際生活污水。有效容積為7 L，每天運行3周期，每周期420 min（厭氧120 min，好氧240 min，沉淀排水60 min），排水比為1∶2。好氧階段溶解氧維持在2~3 mg/L之間，好氧末端亞硝酸鹽積累率達到95%以上。

1.2 試驗水質

SBR1反應器采用人工配水，每升配水所含成分見表1，其中營養液成分(1 L)：1.5 g FeCl3·6H2O， 0.15 g H3BO3， 0.03 g CuSO4·5H2O， 0.18 g KI， 0.12 g MnCl2·4H2O， 0.06 g Na2MoO4·2H2O， 0.12 g ZnSO4·7H2O， 0.15 g CoCl2·6H2O， 10 g EDTA。配水的水質為：COD濃度為800 mg/L，磷酸鹽濃度為20 mg/L。

SBR2反應器的實驗用水取自某生活小區化糞池的實際生活污水，試驗期間平均水質主要參數為：COD=175.7~223.8 mg/L， 平均194.5 mg/L；NH+4-N=60.42~79.43 mg/L， 平均69.44 mg/L；PO3-4-P=4.30~8.28 mg/L，平均5.71 mg/L。

1.3 靜態試驗

從2個SBR反應器好氧末端取4 L污泥，清洗3遍，將清洗后的污泥平均分裝于4個反應瓶中，然后加入人工配水至1.5 L。人工配水中不含磷源和碳源，其余成分如表1所示。向4個反應瓶中分別加入10 mL 30 g/L的乙酸鈉溶液，使其初始碳源濃度達到200 mg/L。同時投加不等量的亞硝酸鈉，使得4個反應瓶中亞硝態氮的濃度分別達到0、10、20和30 mg/L。實驗過程中在線監測pH，用0.5 mol/L的HCL和0.5 mol/L NaOH調節并維持混合液的pH=7.5±0.05，溫度控制為25 ℃±0.5 ℃。

1.4 分析方法

COD、NH+4—N、NO-2—N、PO3-4—P按照標準方法［10］進行測定；采用安捷倫6 890 N系統氣相色譜儀測定PHA（主要包括聚羥基丁酸（PHB）和聚羥基戊酸（PHA））和乙酸；pH值使用德國WTW MultiLine 340i 手提式在線檢測儀測定。

采用熒光原位雜交技術(Fluorescence in-situ hybridization， FISH)分析聚磷菌的富集程度。試驗中采用的16S rRNA寡核苷酸探針如表2所示。其中全菌探針EUBmix由EUB338、EUB338Ⅱ和EUB338Ⅲ混合而成；聚磷菌探針PAOmix 由PAO462、PAO651和 PAO846混合而成。

2 實驗結果和分析

2.1 亞硝酸鹽對人工配水富集聚磷菌厭氧代謝的影響

圖1表示不同亞硝酸鹽濃度下活性污泥1中VFA、PO3-4—P、PHA和NO-2—N濃度的變化。由圖1(a)可看出，與未投加亞硝酸鹽的情況相比，投加亞硝酸鹽的反應瓶中VFA的消耗速率明顯減慢，直至反應進行至120 min反應瓶內仍有VFA剩余。反應進行至70 min時，未投加亞硝酸鹽的反應瓶中VFA已經消耗完，而亞硝態氮濃度分別為10、20和30 mg/L的反應瓶中，VFA的濃度分別為73.88、92.93和98.25 mg/L。由圖1(c)可看出一部分VFA被聚磷菌吸收以PHA的形式儲存在體內，而由圖1(d)可知還有一部分VFA被異養菌作為碳源用于亞硝酸型反硝化反應。亞硝態氮濃度分別為10、20、30 mg/L時，亞硝酸鹽的利用速率基本一致，即反硝化速率沒有明顯的差異。由此可以看出，亞硝酸鹽對聚磷菌吸收VFA的過程造成抑制，但對于亞硝酸鹽的反硝化過程沒有明顯影響。

圖1 不同亞硝酸鹽濃度下活性污泥1中VFA、

PO3-4—P、PHA和NO-2—N濃度的變化

圖1(b)反映了不同亞硝酸鹽濃度下磷酸鹽濃度的變化。與VFA的濃度變化不同，向反應瓶中投加亞硝酸鹽不但沒有減少磷酸鹽的釋放量，反而促進了聚磷菌對磷酸鹽的進一步釋放，在反應進行至70 min時，亞硝酸鹽濃度為30 mg/L的反應瓶中磷酸鹽的釋放量達到67.8 mg/L，比未投加亞硝酸鹽反應瓶中的濃度高6.9 mg/L。在未投加亞硝酸鹽的反應瓶中，反應進行至70 min時，磷酸鹽的釋放量出現了下降的現象，由60.9 mg/L降至54.9 mg/L。觀察圖1(c)亞硝態氮濃度為0時聚磷菌合成PHA的變化情況，發現70 min時PHA濃度也出現了不增加反而下降的現象，PHA濃度由10.20 Cmmol/L降至9.64 Cmmol/L。以上現象說明反應瓶中的VFA被消耗完之后，聚磷菌以體內儲存的PHA為電子供體，以反應瓶中少量溶解氧為電子受體進行吸磷反應。

2.2 亞硝酸鹽對短程脫氮除磷活性污泥中聚磷菌厭氧代謝的影響

圖2表示不同亞硝酸鹽濃度下活性污泥2中VFA、PO3-4—P、PHA和NO-2—N濃度的變化。從圖2(a)可以看出，當亞硝態氮濃度分別為0、10、20、30 mg/L時，VFA分別在120、90、50、50 min消耗完，投加亞硝酸鹽的反應瓶中VFA的利用速率大于未投加亞硝酸鹽的反應瓶中的VFA利用速率。從圖2(c)和圖2(d)可知，對于投加亞硝酸鹽的反應瓶，VFA被聚磷菌吸收除了作為內碳源被儲存于體內之外，還有一部分VFA作為碳源用于亞硝酸型反硝化反應，所以有亞硝酸鹽存在的反應瓶中VFA的消耗速率較快。由圖2(d)亞硝態氮的變化曲線可知，當亞硝態氮濃度為10、20、30 mg/L時，亞硝態氮的消耗速率沒有明顯的差異，說明亞硝酸鹽沒有抑制反硝化反應。

圖2 不同亞硝酸鹽濃度下活性污泥2中VFA、

PO3-4—P、PHA和NO-2—N濃度的變化

圖2(b)表示了不同亞硝態氮濃度下聚磷菌釋放磷酸鹽的濃度變化，從曲線的變化可看出隨著亞硝態氮濃度的增大，聚磷菌釋放磷酸鹽的量減少。另外，可觀察到當亞硝態氮為20和30 mg/L時反應進行至50 min出現磷酸鹽濃度沒有升高反而降低的現象，而圖2(c)中相應濃度下的PHA濃度也出現了一致的變化趨勢。由圖2(d)可看出50 min時，20 mg/L的反應瓶中亞硝態氮全部被反硝化，此時30 mg/L的反應瓶中仍存在5.5 mg/L亞硝態氮。以上現象說明，當反應瓶中碳源消耗完后，聚磷菌能夠以PHA為電子供體，以亞硝酸鹽為電子受體進行吸磷，這也說明該系統中存在反硝化聚磷菌。

由以上分析可知，30 mg/L的亞硝酸鹽對聚磷菌吸收VFA、釋放磷酸鹽、合成PHA和亞硝酸鹽的反硝化過程沒有形成明顯的抑制，但是亞硝酸鹽的存在仍對系統造成一定的影響。厭氧條件下投加亞硝酸鹽，系統中發生異養菌的反硝化作用，引起聚磷菌與普通異養反硝化菌之間對于VFA的競爭。而當系統中的碳源不充足時，聚磷菌不能獲得足量的VFA，導致PHA的合成和磷酸鹽的釋放減少，進而影響好氧吸磷作用，若不補充碳源，最終將導致除磷系統的惡化。

2.3 微生物種群分析

對圖1富集聚磷菌系統中VFA、PO3-4—P、PHA和NO-2—N濃度的變化分析可知，10 mg/L的亞硝酸鹽已對聚磷菌的厭氧代謝造成抑制；而在短程脫氮除磷活性污泥的靜態試驗中，高達30 mg/L的亞硝酸鹽并未對聚磷菌的代謝形成明顯的抑制作用（圖2）。相同的實驗條件下，得到了不同的實驗結果。為了分析造成以上現象的原因，采用熒光原位雜交技術（FISH）對活性污泥1和活性污泥2的微生物進行定量分析。

圖3(a)和圖3(b)分別為活性污泥1和活性污泥2中全菌EUBmix和PAOmix合成圖。經計算可知，活性污泥1中的聚磷菌占到全菌的55％，活性污泥2中的聚磷菌占到全菌的7.6％。由以上分析可知，對于處理實際生活污水的短程脫氮除磷活性污泥，由于生活污水的水質復雜，進水有機物負荷變化較大，污泥中的微生物種群較豐富且抗沖擊負荷能力較強。當系統中有亞硝酸鹽存在時，大量的異養菌能夠利用碳源快速的將亞硝酸鹽還原，從而在一定程度上減弱了亞硝酸鹽作為抑制劑對聚磷菌厭氧釋磷的抑制作用。而富集聚磷菌系統由于長期用人工配水培養聚磷菌，其污泥中微生物的組成較為簡單，對環境變化的適應能力較弱，當系統中加入亞硝酸鹽后，聚磷菌的厭氧代謝受到了抑制作用。

圖3 2種活性污泥中聚磷菌的FISH合成效果圖

2.4 亞硝酸鹽抑制PAOs 厭氧代謝的機理分析

2.4.1 亞硝酸鹽對PAOs吸收VFA的影響 Mino［13］在1987年提出乙酸通過主動運輸的方式進入聚磷菌體內，Smolders等［14］的實驗結果也支持了此觀點。Saunders等［15］在膜運輸水平下對厭氧條件下PAOs吸收VFA的機制進行了更深入的研究，發現乙酸通過細胞膜的驅動力主要來自質子驅動力PMF，即次級運輸。質子驅動力由Pit載體蛋白排出磷和質子而產生［16］。

亞硝酸鹽（NO-2）對微生物的生長和代謝有抑制作用，Yarbrough等［17］研究表明亞硝酸鹽會對大量不同種群的細菌產生抑制作用，通過影響主動運輸、吸收氧氣和氧化磷酸化等過程影響其能量的產生。聚磷菌獲得碳源是以主動運輸的方式，一定量的亞硝酸鹽的存在會影響聚磷菌吸收VFA的過程。

主動運輸的過程需要消耗能量，關于微生物體內ATP形成， 目前最為公認的是Peter D Mitchell在1961年提出化學滲透假說［17］，提出生成ATP的氧化與磷酸化之間起到偶聯作用的是H+的跨膜梯度。現有研究認為亞硝酸鹽是一種解偶聯劑，能夠提高質子通過穿梭機制透過細胞膜的性能，破壞跨膜的質子梯度［18］。在微生物體內，由于細胞膜具有選擇性， H+不能自由的通過細胞膜，于是在細胞膜的兩側形成了質子跨膜梯度，而解偶聯劑能夠提高細胞膜對H+的通透性，從而破壞了細胞膜兩側的質子梯度，抑制ADP+Pi生成ATP的磷酸化作用。由此而推測出，在富集聚磷菌的反應瓶中投加的亞硝酸鹽是解偶聯劑，通過破壞質子驅動力，破壞VFA主動運輸的過程，導致聚磷菌吸收VFA的量減少。

2.4.2 亞硝酸鹽對PAOs釋放磷酸鹽的影響 poly-P存在于所有的細胞中，可見其對細胞功能有著重要的作用。在EBPR系統中，poly-P的作用還不十分清楚，但是目前被廣泛認同的一個重要作用是胞內poly-P的水解能夠為VFA的吸收和PHA的合成提供能量［19］。

厭氧條件下P的釋放和VFA的吸收的比率P/VFA是考察PAOs性能的一個重要參數［14］，表示了PAOs每吸收一個單位的VFA所釋放的P的量，而吸收VFA所需的能量主要來自于poly-P的水解，所以說P/VFA的值體現的是吸收一個單位的VFA所需能量的多少。圖4表示的是富集聚磷菌系統靜態試驗中不同亞硝酸鹽濃度下P/VFA的變化情況。與未投加亞硝酸鹽的情況相比，有亞硝酸鹽存在的系統中P/VFA的值較大，說明當有亞硝酸鹽存在時需要更多的能量用于VFA的吸收。

圖4 富集聚磷菌系統靜態試驗中P/VFA的變化

在厭氧條件下，有亞硝酸鹽的除磷系統中P/VFA的比值較大，說明系統中可能發生了二次釋磷現象。所謂二次釋磷是指在厭氧條件下，不伴隨有機物（如乙酸等）的吸收以及多聚物（如PHB等）的合成的磷釋放。而引起二次釋磷的原因主要有2個：一是厭氧條件下加入降低PMF的物質；二是細菌的內源呼吸引起了胞內多聚磷酸鹽的水解［21］。

Bond等［20］研究表明在堿性條件下，聚磷菌能夠通過降解體內儲存的poly-P調節EBPR系統中的pH。Smolders等［14］研究認為隨著pH值的升高，P/VFA的比值增大，即pH值的升高使得聚磷菌的釋磷能力得到了增強。厭氧條件下，聚磷菌吸收VFA的過程需要消耗PMF，而pH的升高會降低PMF，為了維持PMF值的恒定，聚磷菌需要水解更多的poly-P，所以升高的pH使得聚磷菌釋放磷酸鹽的量增多。由此可推測出，在富集聚磷菌的反應瓶中，厭氧條件下亞硝酸鹽的投加促進了磷酸鹽的釋放，是因為亞硝酸鹽的存在破壞了聚磷菌細胞的PMF，為了維持PMF恒定，為聚磷菌吸收VFA提供能量，聚磷菌需要分解更多的poly-P，為厭氧代謝過程提供能量。

3 結 論

1）人工配水富集聚磷菌的活性污泥中，當亞硝態氮的濃度超過10 mg/L時，聚磷菌吸收VFA的過程受到抑制，使得PHA的合成量減少，釋磷量增加；在SBR短程脫氮除磷活性污泥中，當亞硝態氮濃度達到30 mg/L時，聚磷菌的厭氧代謝沒有受到抑制。

2）人工配水富集聚磷菌的活性污泥，有亞硝酸鹽與未投加亞硝酸鹽的情況相比，P/VFA明顯增大，即有亞硝酸鹽存在時需要更多的能量用于VFA的吸收。

3）SBR短程脫氮除磷活性污泥加入亞硝酸鹽后發生異養菌的反硝化作用，引起異養反硝化菌與聚磷菌競爭VFA，在碳源不充足的情況下，造成聚磷菌合成PHA和釋磷量的減少。

4）厭氧條件下，來自不同工藝的污泥對于亞硝酸鹽的耐受能力不同，與活性污泥的微生物組成有關。采用FISH技術對2種活性污泥中的聚磷菌做定量分析，發現人工配水富集聚磷菌活性污泥中聚磷菌含量達到55%，而短程脫氮除磷活性污泥中的聚磷菌為7.6%。處理生活污水的活性污泥菌群比人工配水富集聚磷菌系統中的菌群更加復雜，其對亞硝酸鹽的耐受能力更強。

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（編輯 胡英奎）