高效液相色譜法檢測糖化血紅蛋白的方法學評價

張文華，侯晗宇，張建榮，王菊英，周立榮（寧夏醫科大學總醫院醫學實驗中心，銀川 750004）

糖化血紅蛋白（HbA1c）作為糖尿病篩選、診斷、血糖控制、療效評價的有效指標，在臨床上已廣泛使用，是監測糖尿病的金標準［1］，高效液相色譜法（HPLC）則被列為檢測 HbA1c參考方法。本中心引進一臺日本TOSOH公司HLC－723 G8全自動糖化血紅蛋白分析儀，除用于測定HbA1c外，還可獲得Hb A1、血紅蛋白F（HbF）的值，現對其檢測HbA1c性能進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血樣本，來自本院門診及住院患者。

1.1.2 儀器 日本TOSOH公司HLC－723 G8全自動糖化血紅蛋白分析儀。

1.1.3 試劑 試劑（批號 EB－102S）、校準品（批號ZS0002）、質控品（批號100842），均為原裝配套，由日本TOSOH公司提供。

1.2 方法 樣本檢測前均采用原公司提供的配套校準品進行校準，并用2個濃度水平的質控品進行控制，結果在控，手工操作步驟嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》［2］進行。

1.2.1 精密度試驗

1.2.1.1 批內試驗 選取新鮮全血樣本，含正常、異常濃度，分別測定HbA1c的含量，在一天內重復測定20次，計算變異系數。

1.2.1.2 批間試驗 采用質控品，含正常、異常濃度，分別測定HbA1c的含量，每天上下午各測定1次，連續測定10 d，計算變異系數。

1.2.2 準確度試驗 使用校準物在分析儀上連續進行10次分析，統計結果，計算結果均值與標定值的偏倚，偏倚應小于或等于3.0%。

1.2.3 攜帶污染率 取高濃度全血樣本，混合均勻后連續測定3次，測定值分別為H1、H2、H3；再取低濃度全血樣本，連續測定3次，測定值分別為L1、L2、L3。按公式計算攜帶污染率（≤3.0%）。攜帶污染率＝（L1－L3）×100%／（H3－L3）。

1.2.4 線性試驗 （1）選取高值 HbA1c（18.1%）和低值HbA1c（4.7%）的人全血樣品。（2）吸取20μL的高值樣品注入樣品管，加入4 mL（200倍稀釋）溶血洗凈液配制成樣品A。（3）吸取20μL的低值樣品注進樣品管，加入4 mL（200倍稀釋）溶血洗凈液配制成樣品B。（4）在分析儀上測定樣品A和樣品B，根據打印結果分別確認兩個樣品的色譜峰總面積（Total Area），該總面積表示HbA1c的濃度。（5）調整總面積，使樣品A與樣品B的色譜峰總面積相近，此時調整后樣品B的濃度為4.6%。（6）按照100%、80%、60%、40%、20%、0%比例稀釋混勻（B為稀釋液），每個樣品檢測3次，對檢測結果的均值和預期值進行直線回歸統計。將實測值與理論值作比較（偏離應小于10%），計算y＝a x＋b，驗證線性。（7）要求：a值在1±0.05范圍內，相關系數r2≥0.95。

2 結 果

2.1 精密度試驗 見表1。

2.2 準確度試驗 見表2。

2.3 攜帶污染率 本次試驗驗證的攜帶污染率為1.09%，滿足要求（≤3.0%）。

2.4 線性試驗 將檢測結果的均值和預期值進行直線回歸統計。將實測值與理論值作比較（偏離應小于10%），計算y＝a x＋b，其中a＝0.9832，r2＝0.9922，滿足要求（a值在1±0.05范圍內，相關系數r2≥0.95）。

表1 精密度試驗

表2 準確度試驗－定值校準品

3 討 論

HbA1c水平反映的是在檢測前120 d內的平均血糖水平，而與抽血時間、患者是否空腹等因素無關，是監測糖尿病控制情況的良好指標［3］。

美國頒布的《臨床實驗室修正法案的最終法規》、ISO 15189醫學實驗室認可標準以及美國病理家學會（CAP）的認證標準［4-6］均要求實驗室對引進或改變的檢測系統進行性能驗證后方可用于常規工作。全自動糖化血紅蛋白分析儀HLC－723 G8基于高效液相色譜分析法的原理，通過陽離子交換柱利用電位差將血紅蛋白組分分離。利用3種不同濃度洗脫液使包括HbA1c在內的多種血紅蛋白進行梯度分離，分離成6個部分。經檢測器檢測分離后的各血紅蛋白組分的吸光度，以百分率形式表示出各血紅蛋白的組分結果與色譜圖。作者通過測定全血中HbA1c的含量，從以下幾個方面對該儀器性能進行綜合評價。

3.1 精密度 批內變異系數小于1.0%，批間變異系數小于1.3%，符合CLIA′88對室間評估的允許誤差要求，1／4允許誤差范圍為批內不精密度判斷限（≤3.0%），1／3允許誤差范圍為日間不精密度判斷限（≤4.0%），說明該儀器的重復性好，測定結果穩定。

3.2 準確度評價 分析廠商提供的HbA1c校準品，用校準品校準后，連續重復測定該批號校準品10次，統計結果，計算檢測均值與標定值的偏倚，測試結果偏倚均小于3.0%，滿足要求，說明該儀器準確性高。

3.3 其攜帶污染率小于或等于3.0%，樣品間的交叉污染極小，滿足檢測要求。

3.4 通過線性試驗，可觀察各稀釋點均呈現較好線性，a值及r2均滿足要求，試驗所驗證項目的測量范圍符合線性。綜上所述，全自動糖化血紅蛋白分析儀HLC－723 G8精密度高、準確性好、交叉污染極小，且具有良好線性等優點；另外，測試速度快、操作簡便。為臨床調整糖尿病治療方案提供準確依據，有很好的應用前景。

［1］王笠，李琳.糖化血紅蛋白的檢測和臨床應用［J］.上海醫學檢驗雜志，2003，18（2）：119－121.

［2］葉應嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規程［M］.3版.南京：東南大學出版社，2006：223.

［3］紀立農，寧光.糖化血紅蛋白［M］.北京：人民衛生出版社，2010：2－16.

［4］魏昊，叢玉隆.醫學實驗室質量管理與認可指南［M］.北京：中國計量出版社，2004：59－75.

［5］Department of Health and human Services，Centers for Medicare ＆ Medicaid Services.Clinical Laboratory improvement amendments of 1988：final rule［M］.Fed Register，2003：3704.

［6］畢波，呂元.定量檢測方法學性能驗證的系統設計［J］.中華檢驗醫學雜志，2007，30（2）：143－145.