不同劑量尼古丁對(duì)成年大鼠陰莖海綿體內(nèi)源性CO含量及NOS活性影響的研究

徐 輝，于 滿，王志勇，辛立升,王振潮,馬英慧

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.泌尿外科；2.眼科，河北承德 067000)

陰莖勃起是一種神經(jīng)血管反應(yīng)過程。勃起功能障礙(erectile dysfunction,ED)是男子最常見的性功能障礙，其發(fā)病率占中老年男性的50%，中國約有一億多男性患有ED，嚴(yán)重影響夫妻生活質(zhì)量[1]。近10余年來，對(duì)于復(fù)雜的陰莖勃起機(jī)制，研究的重點(diǎn)已由血流動(dòng)力學(xué)移向神經(jīng)介質(zhì)方面。研究表明，一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸生成的一氧化氮(NO)是介導(dǎo)陰莖勃起的最主要的非膽堿能非腎上腺能(NANC)神經(jīng)遞質(zhì)，在陰莖勃起過程中起著決定性作用[2]。研究證實(shí)，內(nèi)源性一氧化碳(CO)是一種新型的神經(jīng)遞質(zhì)[3]，是陰莖勃起的一種基本遞質(zhì)，參與陰莖勃起過程[4]。吸煙是公認(rèn)的ED的危險(xiǎn)因素。尼古丁是香煙煙霧中含量最高的一種成分，本實(shí)驗(yàn)通過制備成年雄性大鼠尼古丁給藥動(dòng)物模型，觀察大鼠陰莖勃起情況，檢測陰莖海綿體CO含量及NOS活性，分析不同劑量尼古丁對(duì)其影響，進(jìn)而探討吸煙對(duì)勃起功能的影響及ED發(fā)生的生理機(jī)制，為臨床上性功能障礙的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1動(dòng)物 成年12周齡雄性Wistar大鼠32只。

1．1．2試劑及藥物 考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，NOS測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，尼古丁(Sigma公司)，連二亞硫酸鈉(還原劑)(南京建成生物工程研究所)，KH2PO4(南京建成生物工程研究所)，阿撲嗎啡(APO，Sigma公司)。

表1 各組大鼠陰莖勃起次數(shù)及海綿體內(nèi)源性CO濃度及NOS活性比較±s,n=8)

1．2方法

1．2．1動(dòng)物分組 選取純系12周齡雄性Wistar大鼠32只，隨機(jī)分成4組，每組各8只，分別為對(duì)照組、尼古丁(0.5 mg·kg-1·d-1)組、尼古丁(1.5 mg·kg-1·d-1)組、尼古丁(2.5 mg·kg-1·d-1)組。

1．2．2動(dòng)物模型的制備 各組動(dòng)物分籠單獨(dú)飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合飼料喂養(yǎng)。將尼古丁溶于生理鹽水中制成注射液。尼古丁組(0.5 mg·kg-1·d-1)每日1次皮下注射尼古丁0.5 mg·kg-1·d-1，尼古丁組(1.5 mg·kg-1·d-1)每日1次皮下注射尼古丁1.5 mg·kg-1·d-1，尼古丁(2.5 mg·kg-1·d-1)組每日1次皮下注射尼古丁2.5 mg·kg-1·d-1。給藥容積為0.5 mL/kg，對(duì)照組每日1次皮下注射等容積的生理鹽水。

1．2．3陰莖勃起功能測定 8周后，選擇安靜的房間內(nèi)，將大鼠置于玻璃板上，在每只大鼠頸項(xiàng)部皮下注射阿撲嗎啡90 μg/kg體質(zhì)量，觀察30 min，記錄陰莖勃起次數(shù)。以陰莖頭充血及陰莖末端露出為勃起1次

1．2．4動(dòng)物處理及取材 勃起功能檢測后，乙醚(99%)麻醉各組大鼠，頸椎脫臼法處死，切開陰莖包皮仔細(xì)分離并剝離出陰莖組織(包括球部及海綿體腳)，迅速置于冰冷的改良Krebs液中，去除龜頭(含陰莖軟骨)、尿道海綿體及陰莖背側(cè)血管，取陰莖海綿體。

1．2．5組織勻漿的制備 將取出的海綿體組織用4 ℃蒸餾水沖洗后，濾紙吸干，電子天平稱質(zhì)量，用眼科小剪將海綿體組織剪成小塊，加入體積總量是海綿體重量9倍的0.86%的冷生理鹽水，在冰浴中用電動(dòng)內(nèi)切式勻漿機(jī)制備成10%的組織勻漿，4 ℃低溫離心機(jī)內(nèi)，以10 000 r/min離心20 min，取上清液即為10%的海綿體勻漿。

1．2．6陰莖海綿體勻漿中蛋白含量測定(考馬斯亮蘭法) 取10%陰莖海綿體勻漿上清液用生理鹽水按1∶9稀釋成1%組織勻漿，按試劑盒說明操作，測各管吸光度值。將吸光度值代入公式計(jì)算蛋白含量。

1．2．7CO濃度的測定 取10%的海綿體勻漿按文獻(xiàn)[5]的方法測定CO濃度。

1．2．8NOS活性的測定 取10%的海綿體勻漿按測定試劑盒說明操作，測各管吸光度值。將吸光度變化的差異代入NOS酶活性計(jì)算公式算出總NOS活性。

2 結(jié) 果

2．1觀察大鼠外觀 對(duì)照組大鼠生長迅速，體質(zhì)量逐日增加，毛色白，有光澤，活動(dòng)靈敏，進(jìn)食正常。尼古丁各組大鼠出現(xiàn)精神不振、食欲減退、體質(zhì)量減輕、毛色發(fā)黃、無光澤、粗糙稀少、對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍、少活動(dòng)等表現(xiàn)。

2．2陰莖勃起功能測定 尼古丁注射各組大鼠陰莖勃起次數(shù)都較對(duì)照組降低(P<0.01)。尼古丁給藥時(shí)間越長，陰莖勃起次數(shù)越少。尼古丁注射各組間兩兩比較，尼古丁(0.5 mg·kg-1·d-1)組與尼古丁(1.5 mg·kg-1·d-1)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；尼古丁(1.5 mg·kg-1·d-1)組與尼古丁(2.5 mg·kg-1·d-1)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，尼古丁(2.5 mg·kg-1·d-1)組與尼古丁(0.5 mg·kg-1·d-1)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2．3NOS活性定量分析 尼古丁注射各組大鼠陰莖海綿體勻漿中NOS活性都較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。尼古丁給藥時(shí)間越長，NOS活性越低。尼古丁注射各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2．4內(nèi)源性CO濃度測定 尼古丁注射各組大鼠陰莖海綿體勻漿中CO濃度都較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。尼古丁給藥時(shí)間越長，內(nèi)源性CO含量越低。尼古丁注射各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

3 討 論

陰莖勃起是一個(gè)復(fù)雜的心理-生理過程，本質(zhì)是一系列神經(jīng)-血管活動(dòng)，是神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)控下陰莖海綿體血流動(dòng)力學(xué)變化過程。陰莖勃起和疲軟態(tài)的血流動(dòng)力學(xué)受海綿體平滑肌舒張和收縮調(diào)控。正常陰莖勃起機(jī)制決定于海綿體平滑肌收縮與舒張的精確平衡[6]。海綿體平滑肌收縮由交感神經(jīng)釋放去甲腎上腺素激活α-腎上腺能受體所調(diào)控，而舒張則由副交感神經(jīng)釋放的乙酰膽堿和神經(jīng)遞質(zhì)NO介導(dǎo)[7]。ED的病因?qū)W分為幾個(gè)主要方面，20年前認(rèn)為80%的ED是心理性的，但現(xiàn)在廣泛承認(rèn)最常見并可解釋大多數(shù)病例的原因是血管病變，許多血管疾病的危險(xiǎn)因子與ED的危險(xiǎn)性有關(guān)，包括吸煙，血清總膽固醇濃度。吸煙可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，引起血管收縮，減少陰莖血流和增加血液黏稠度，同時(shí)可增加血液中CO2含量，減少陰莖氧供。因此，吸煙是ED的危險(xiǎn)因素，是公認(rèn)的器質(zhì)性ED發(fā)生的危險(xiǎn)因子。尼古丁是香煙煙霧中的一種重要成分，是煙草致病的主要成分之一，屬吡啶衍生物類生物堿，是一種難聞、味苦、無色透明的油質(zhì)液體，揮發(fā)性強(qiáng)，在空氣中極易氧化成暗灰色，能迅速溶解于水及乙醇中，通過口、鼻、支氣管黏膜很容易被機(jī)體吸收，有劇毒，少量對(duì)中樞神經(jīng)有興奮作用，能升高血壓，大量則抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使心臟麻痹以致死亡。本實(shí)驗(yàn)中參考藍(lán)曉紅等[8]皮下注射尼古丁的方法，制備尼古丁給藥動(dòng)物模型，觀察成年大鼠陰莖勃起次數(shù)，發(fā)現(xiàn)尼古丁給藥各組大鼠陰莖勃起次數(shù)較對(duì)照組明顯下降，說明尼古丁能導(dǎo)致大鼠ED。觀察中發(fā)現(xiàn)尼古丁給藥劑量越大，陰莖勃起次數(shù)越少，尼古丁(2.5 mg·kg-1·d-1)組較尼古丁(0.5 mg·kg-1·d-1)組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，尼古丁(1.5 mg·kg-1·d-1)組較尼古丁(0.5 mg·kg-1·d-1)組、尼古丁(2.5 mg·kg-1·d-1)組較尼古丁(1.5 mg·kg-1·d-1)組亦減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，分析原因可能與本研究設(shè)計(jì)的劑量梯度不足夠大、樣本數(shù)偏小有關(guān)。在實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)，尼古丁各組大鼠出現(xiàn)精神不振、食欲減退、體質(zhì)量減輕、毛色發(fā)黃、無光澤、粗糙稀少、對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍、少活動(dòng)等表現(xiàn)，再次證實(shí)吸煙的危害。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，吸煙對(duì)勃起功能的損害是多方面的。主要包括：對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的影響、對(duì)外周神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響、對(duì)性激素的影響。已有研究表明吸煙對(duì)交感神經(jīng)的影響是通過尼古丁的作用實(shí)現(xiàn)的。NO在體內(nèi)是通過NOS催化L-精氨酸產(chǎn)生的，NO非常活躍，半衰期僅為數(shù)秒鐘，很難對(duì)其進(jìn)行精確的研究，而NOS是NO合成過程的限速酶，可作為研究NO的替代，NOS活性降低是導(dǎo)致ED的主要原因[9]。Xie等[10]將成年大鼠(5月齡)和老年大鼠(20月齡)分別暴露在香煙的煙霧中被動(dòng)吸煙8周，結(jié)果成年大鼠和老齡大鼠陰莖組織總NOS活性分別下降73%、62%。國內(nèi)杜國順和胡禮泉[11]將4、10、16月齡的Wistar雄性大鼠放于密閉容器內(nèi)被動(dòng)吸煙2個(gè)月，發(fā)現(xiàn)吸煙組大鼠與對(duì)照組相比，NOS活性分別下降41%(4月齡)、69%(10月齡)和58%(16月齡)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。然而有關(guān)香煙煙霧的主要成分——尼古丁對(duì)大鼠陰莖海綿體NO類血管舒張因子影響的研究，目前報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過檢測尼古丁給藥各組大鼠陰莖海綿體NOS活性，發(fā)現(xiàn)尼古丁給藥各組大鼠NOS活性顯著下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，尼古丁劑量越大，NOS活性越低，尼古丁給藥各組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明尼古丁可通過抑制NOS活性，從而致NO合成不足，導(dǎo)致陰莖舒張能力減弱而致ED。

內(nèi)源性CO是近十幾年來研究證實(shí)的重要的細(xì)胞信使分子之一。研究表明，內(nèi)源性CO的作用方式類似于NO[12-13]，二者在生理功能上有許多共同點(diǎn)。內(nèi)源性CO主要由血紅素氧合酶(heme oxygenase,HO)催化分解血紅素而產(chǎn)生。HO有HO-1、HO-2和HO-3共3種同工酶。研究發(fā)現(xiàn)，CO可以減弱大鼠陰莖海綿體的張力，HO的抑制劑能抑制海綿體的舒張效應(yīng)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，陰莖海綿體上的HO-2和內(nèi)皮型NOS參與調(diào)節(jié)陰莖的勃起[15]。可見，CO/HO在陰莖勃起中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過測定實(shí)驗(yàn)各組大鼠陰莖海綿體內(nèi)源性CO含量，發(fā)現(xiàn)尼古丁給藥的各組大鼠陰莖海綿體內(nèi)源性CO含量顯著降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，尼古丁劑量越大，CO含量越低，尼古丁給藥各組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明尼古丁對(duì)大鼠勃起功能的影響有內(nèi)源性CO的參與，從而說明內(nèi)源性CO是吸煙引起ED的一種新型神經(jīng)遞質(zhì)，為探討吸煙致ED的發(fā)生機(jī)制及臨床治療提供新的途徑。有關(guān)其確切機(jī)制和臨床意義的研究極有價(jià)值，有待深入研究。

[1]辛鐘成.重度勃起功能障礙的診斷與治療進(jìn)展[J].臨床泌尿外科雜志，2006,21(3):161-163.

[2]郭應(yīng)祿，胡禮泉．臨床男科學(xué)[M]．武漢：湖北科技出版社，1996：298-306．

[3]薛啟蓂．一氧化碳是一種新型氣體神經(jīng)介質(zhì)[J]．中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2004，11(4)：239-242．

[4]郭玉剛，秦文波，宋文君，等．內(nèi)源性一氧化碳對(duì)離體犬陰莖海綿體平滑肌的作用[J]．中華男科雜志，2006,12(8)：685-688.

[5]曾錦生，葉啟發(fā)．血漿一氧化碳測定的改良雙波長分光光度法[J]．中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2002，12(1)：40-41．

[6]Taub HC,Lerner SE,Melman A,et al.Relationship between contraction and relaxation in human and rabbit corpus cavernosum[J].Urology,1993,42(9):698-701.

[7]Burnett A.Nitric oxide in the penis:physiology and pathology[J].J Urol,1997,157(4):320-323.

[8]藍(lán)曉紅,徐添穎，繆朝玉.尼古丁給藥和撤藥模型的制備與評(píng)價(jià)[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(2):156-158.

[9]劉繼紅,王濤.勃起功能障礙的基因治療與一氧化氮合酶[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志,2003,8(1):63-64.

[10]Xie Y,Garban H,Ng C,et al.Effect of long-term passive smoking on erectile function and penile nitric oxide synthase in the rat[J].J Urol,1997,157(10):1121-1126.

[11]杜國順,胡禮泉.長期吸煙加速老齡鼠性功能的退化[J].中華泌尿外科雜志,1999,20(6):745-746.

[12]Abdel Aziz MT,Mostafa T,Atta H,et al.Oral phosphodiesterase-5 inhibitors:effect of heme oxygenase inhibition on cGMP signalling in rat cavernous tissue[J].Andrologia,2007,39(2):66-70.

[13]Abdel Aziz MT,El-Asmer MF,Mostafa T,et al.Heme oxygenasevs.nitric oxide synthase in signaling mediating sildenafil citrate action[J].Sex Med,2007,14(7):1098-1107.

[14]Ushiyama M,Morita T,Kuramochi T,et al.Erectile dysfunction in hypertensive rats results from impairment of the relaxation evoked by neurogenic carbon monoxide and nitric oxide[J].Hypertens Res,2004,27(4):253-261.

[15]Hedlund P,Ny L,Alm P,et al.Cholinergic nerves in human corpus cavernosun and spongiosum contain nitric oxide synthase and heme oxygenase[J].J Urol,2000,164(6):868-875.