厄貝沙坦對2型糖尿病大鼠腎小管上皮細胞MMP-2/TIMP-2和α-SMA表達關系的影響

李 華，董駿武，吳 揚，宋小紅，李承旭，蔡 源

(華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院腎內科，武漢 430030)

近年大量研究發現，糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)時腎小管病變及小管間質纖維化對腎功能的影響較腎小球病變更為重要，腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化(tubular epithelial myofibroblast transdifferentiation,TEMT)是腎間質纖維化的重要發病機制之一，抑制或逆轉腎小管上皮細胞轉分化對延緩腎功能衰竭具有重要的臨床意義[1]。研究表明，基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)參與早期DN腎小球基底膜的損傷及腎小管萎縮和腎間質纖維化[2]，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)參與腎管端小管細胞MMP-2的表達調節[3]，本研究的目的旨在觀察血管緊張素Ⅱ 1型受體拮抗劑(ARB)厄貝沙坦對2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)大鼠腎小管上皮細胞MMP-2及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表達關系的影響，探討厄貝沙坦的腎臟保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1動物模型的建立與分組 18只清潔級健康雄性Wistar大鼠，體質量180～200 g(購自華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心，為同一批繁殖)，給予基礎飼料(蛋白質22%，脂肪10%，碳水化合物60%，其他8%)喂養適應環境2周后，隨機分為正常對照組(A組)6只和模型組12只，A組繼續予以基礎飼料喂養，模型組則參照文獻[4]建立T2DM大鼠模型，先喂以高糖、高脂飼料(常規飼料加20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇)，4周后左下腹單次注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司，30 mg/kg溶于0.1%檸檬酸緩沖溶液，pH 4.4)，以非空腹血糖大于或等于16.7 mmol/L、伴胰島素敏感性降低作為T2DM大鼠模型成功標準。造模成功后將成模動物再隨機分成DM對照組(B組)及厄貝沙坦治療組(C組)各6只，C組在造模成功后即開始喂服厄貝沙坦(50 mg·kg-1·d-1，杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司)，B組則以等體積蒸餾水灌胃。

1.2標本的收集與處理 于8周末，各組大鼠用代謝籠收集24 h尿，-30 ℃保存，次日用乙醚麻醉，從心臟采血，留取血、尿標本后立即打開腹腔，游離并取出雙腎，以4 ℃生理鹽水洗凈，小心剝去腎包膜，再以4 ℃生理鹽水沖洗腎血管3次，右腎稱質量后，以10%中性甲醛固定，石蠟包埋，制成2 μm厚切片。

表1 各組動物生化指標及腎臟病變情況±s)

續表1 各組動物生化指標及腎臟病變情況±s)

q≥3.49，a:P<0.05，與A組比較；q≥2.89，b:P<0.05，與B組比較。

1.3生化指標檢測 留取的血、尿標本檢測血糖、血肌酐、尿肌酐、尿清蛋白(免疫散射比濁法)、血胰島素(放射免疫法)等指標，并參照有關公式計算內生肌酐清除率(Ccr)。

1.4組織病理學觀察 石蠟切片HE、PAS染色，光鏡下觀察腎組織形態學改變，采用HPIAS-1000型醫學圖像分析系統6.0，每只動物選2張切片，每張切片在高倍鏡下連續觀察50個視野，按腎小管上皮細胞擴張、萎縮、炎性細胞浸潤、腎間質纖維化等病變程度，將腎小管損傷分為4級：(-)為無腎小管病變；(+)為輕度，病變范圍小于20%；(++)為中度，病變范圍20%～40%；(+++)為重度，病變范圍大于40%。記錄連續不重疊的20個高倍鏡視野內積分，取均值作為腎小管損傷的指數。

1.5免疫組織化學檢測 兔抗鼠 α-SMA、MMP-2單克隆抗體、免疫組織化學超敏S-P試劑盒均購自武漢博士德生物工程公司。采用S-P法檢測 α-SMA、MMP-2。詳細步驟嚴格按照說明書進行。用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照，用DAB顯色，蘇木素復染。每張切片在高倍鏡(×400)下隨機選擇20個視野，以胞漿出現棕黃色染色為陽性信號，采用HPIAS-1000型醫學圖像分析系統進行分析，測定該區域的積分吸光度值，以均值表示每個標本的積分吸光度，最后進行各組均值比較。

2 結 果

2.1各組動物生化指標變化情況 B組體質量、血糖、血三酰甘油、膽固醇、低密度脂蛋白均較A組顯著升高(P<0.05)；C組與B組比較上述指標有不同程度下降，但差異無統計學意義(P>0.05)；3組之間高密度脂蛋白差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。B組腎重指數、24 h尿清蛋白排泄量均較A組增高(P<0.05)；C組以上指標雖較A組增高但差異無統計學意義(P>0.05),與B組比較差異有統計學意義(P<0.05)，Ccr結果與之相反，見表1。

2.2各組動物腎臟病變情況 PAS染色A組腎小球未見病理改變；B組腎小球體積增大，基底膜增厚，細胞外基質ECM增多，系膜區擴大，部分腎小管輕度萎縮或管腔擴張，上皮細胞水腫，呈區域性分布，胞漿內可見脂肪空泡，多位于基底部；C組則上述病理變化有所改善，見封2圖1。B組腎小管損傷指數較A組明顯增高，差異有統計學意義(P<0．05)，C組腎小管損傷指數雖較A組增高，但與B組比較則明顯減少，差異有統計學意義(P<0．05)，見表1。

2.3免疫組織化學檢測腎臟MMP-2、TIMP-2、α-SMA蛋白表達 B組中腎小管上皮細胞可見α-SMA大量表達，而C組只在腎小管上皮細胞中呈散在表達，表達強度明顯減弱(表2，封2圖2～4)。

表2 大鼠腎臟MMP-2、TIMP-2、α-SMA染色相對含量

2.4相關分析 糖尿病腎病大鼠腎小管損傷指數、α-SMA蛋白含量與TIMP-2呈明顯的正相關(n=18,r=0.90,P<0.05)，與Ccr呈明顯的負相關；α-SMA蛋白與MMP-2蛋白含量之間呈明顯負相關(n=18,r=-0.85,P<0.05)。

3 討 論

MMP-2在A組大鼠腎小球系膜細胞、毛細血管內皮細胞及腎小管上皮細胞呈散在表達，B組的表達較A組減弱，C組的表達強度介于A、B兩組之間，TIMP-2表達與之相反，見表2、封2圖2～3。正常大鼠α-SMA只在血管壁表達，近曲小管上皮細胞胞漿內無表達。本實驗所制備的動物模型具有高血糖、高胰島素血癥伴肥胖、脂代謝異常等類似人類T2DM臨床特點；該模型8周時出現腎臟體積增大、尿清蛋白排泄量增加、Ccr降低、腎小球肥大、基底膜增厚及細胞外基質增多、系膜區擴大、早期腎小管纖維化等DN的病理特征。

DN特征性病理改變是基底膜增厚、腎小球結節性硬化，因此，既往許多ARB類藥物腎保護作用機制的研究多集中在腎小球病變。但近年來越來越多的研究認為腎間質纖維化，特別是腎小管上皮細胞EMT在DN發病機制中發揮著重要的作用[5]。TEMT即腎小管上皮細胞在病理條件下轉化為肌成纖維細胞(myofi-broblast，MyoF)的過程，MyoF是一種處于激活狀態的細胞，它同時具有成纖維細胞和肌細胞的特性，可表達波形蛋白和α-SMA，并分泌大量細胞外基質，促發腎間質纖維化的發生[6]，因而α-SMA是肌成纖維母細胞的標記分子，α-SMA表達增加是腎小管轉分化的重要標志。本實驗結果顯示,DN大鼠腎小管損傷指數、α-SMA蛋白含量明顯升高且與Ccr呈明顯的負相關，提示DN不僅存在基底膜增厚、腎小球結節硬化等腎小球病變，同時存在腎小管轉分化、腎小管損傷的發生，且腎功能與之密切相關。

Ⅳ型膠原是腎小球基底膜和腎小管基底膜的主要組分，形成三維網狀骨架，對維持基底膜的結構和生理功能有著舉足輕重的作用[7]，由于其具有獨特的螺旋結構，大部分降解酶對它沒有作用。基質金屬蛋白酶家族中的MMP-9、MMP-2，又稱Ⅳ型膠原酶A、B，是Ⅳ型膠原的專一降解酶，MMP-2是一類具有Zn2+依賴性的內源性蛋白水解酶，TIMP-2是其特異性抑制劑，生理狀態下，MMP-2與TIMP-2處于相對平衡狀態，兩者相互拮抗維持基底膜正常代謝。本實驗結果顯示，DN大鼠腎臟MMP-2表達水平明顯低于正常對照組，TIMP-2則明顯高于正常對照組，與既往研究結果一致[2，8]，且MMP-2與α-SMA呈負相關，TIMP-2與α-SMA呈正相關，表明MMP-2/TIMP-2與DN腎小管纖維化密切相關。目前，現有的體內外實驗證實[2]，TGF-β1是最重要的MMPs的調節因子。且是一種公認的致纖維化因子。大量的實驗表明[9-10]，糖尿病或高糖狀態下TGF-β1是升高的。糖尿病狀態下，TGF-β1受血糖、Ang-Ⅱ、血管張力等多種因素調節[11-13]，MMP-2/TIMP-2是其調節的眾多的下游因子之一，而MMP-2/TIMP-2只是基質金屬蛋白酶大家族成員中的一種，提示DN的發病機制存在多種途徑，多靶點全方位治療才是有效防治DN的方向。本實驗結果顯示，厄貝沙坦干預后MMP-2表達有所增加，而TIMP-2表達有所減少，α-SMA蛋白含量明顯減少，提示厄貝沙坦具有延緩腎小管纖維化進展的作用。

[1]Zeisberg M,Kalluri R.The role of epith elial to megenchymal transition in renal fibrosis[J].J Mol Med,2004,82(3):175-177.

[2]Cheng S,Polio AS,Mabimbar R,et al.Matrix metalloproteinase 2 and basement membrane in-tegrity:a unifying mechanism for progressive renal injury[J].FASEB J,2006,20(11):1898-1900.

[3]Han SY.Jce YIH,Han KH,et al.An imbalance between matrix metallopreteinase-2 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2 contributes to the development of early diabetic nephropat-hy[J].Nephrol Dial Transplant,2006,21(9):2406-2410.

[4]高蘋，賈汝漢，王學玉.厄貝沙坦對T2DM大鼠腎組織中核因子-kB的調節[J].中華腎臟病雜志，2002,10(3):364-366.

[5]Yang J，Liu Y．Dissection of key events in tubular epithelial to myofibroblast transiton and itsimplication in renal interstitial fibrosis[J]．Am J Pathol，200l，159(14)：1465-1467．

[6]Yang JW，Liu YH．Blockage of tubular epithelial to myofibroblast transition by hepatocyte g-rowth factor prevents renal interstitial fibrosis[J].J Am Soc Nephrol,2002,13(1):96-98.

[7]Sinniah R,Khan TN.Renal tubular basement membrane changes in tubulointerstitial damage in patients with glomerular diseases[J].Ultrastruct Pathol,1999,23(6):359-362.

[8]Lelongt B,Legallier B,Piedagnel R,et al.Do matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9(gelatinases) play a role in renal development,physiology and glomerular diseases?[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2001,10(1):7-9.

[9]Isono M,Mogyorósi A,Han DC，et al.Stimulation of TGF-beta type Ⅱ receptor by high glucose in mouse mesangial cells and in diabetic kidney[J].Am J Physiol Renal Physiol,2000,278(5):830-833.

[10]Singh R,Alavi N,Singh AK,et al.Role of angiotensin Ⅱ in glucose-induced inhibition of mesangial matrix degradation[J].Diabetes,1999,48(15):2066-2069.

[11]Sharma K,Ziyadeh FN.Hyperglycemia and diabetic kidney disease:The case for transforming growth factor as a key mediator[J].Diabetes,1995,44(10):1139-1142.

[12]李慧芳，王霞，徐睿,等.伊貝沙坦對早期糖尿病腎病大鼠血漿中Ang Ⅱ濃度及t-PA和PAI-1活性的影響[J].重慶醫學，2004,33(10):1515-1517.

[13]Wolf G,Ziyadeh FN.The role of angiotensin Ⅱ in diabetic nephropathy:Emphasis on nonhemod-ynamic mechanisms[J].Am J Kidney Dis,1997,29(1):153-155.