鹽酸普萘洛爾單向灌流法大鼠在體腸吸收的研究

張小華，陳力學，賈毅敏△

(1 重慶市腫瘤研究所藥劑科 400030;2 重慶醫科大學附屬第一醫院實驗研究中心 400016)

在新藥和口服藥物制劑的處方前研究中，有必要對藥物在口服后體內的吸收情況進行預測。小腸是口服藥物被吸收的主要器官，探討在小腸中藥物的吸收過程，可以為藥物新劑型的研發提供依據[1]。本研究采用大鼠單向灌流模型，探討鹽酸普萘洛爾(propranolol hydrochloride，PNH)的腸吸收情況，為鹽酸普萘洛爾制劑合理選擇處方和臨床藥代動力學與藥效學的深入研究奠定基礎。為了避免單向灌流法“標示物”給測定帶來的影響，本實驗引入了一種相對簡單的重量法(gravimetric method)來標示灌流液體積[2]。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級健康成年雄性SD大鼠，體質量(250±20)g，重慶醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(渝) 2007-0001。PNH(純度99.9％，常州亞邦制藥有限公司，批號M060215)，烏拉坦(上海化學試劑廠產品，批號090612)，甲醇(色譜純，山東禹王試劑廠，批號20090306052)，其他試劑均為分析純。Krebs-Ringer緩沖液為灌流液[3]，其組成為：NaCl 133.5 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl23.3 mmol/L，NaH2PO42.67 mmol/L，MgCl20.21 mmol/L，NaHCO316.3 mmol/L，D-Glucose 7.8 mmol/L。供試液中PNH濃度為15 μg/mL。

1.2儀器 蠕動泵BT00-100M(保定蘭格恒流泵有限公司)；高效液相色譜儀(LC-10AT VP，SHIMADZU，日本)；紫外檢測器(SPD-10A VP，SHIMADZU，日本)；色譜柱(C18柱，5 μm，150.0×4.6 mm，Dikma，日本)；電子分析天平(上海分析儀器廠)，HH-6型數顯恒溫水浴鍋(江蘇省榮華儀器制造公司)，JA-1003 型電子分析天平(中國上海精科天平廠)。

1.3方法

1.3.1色譜系統的適用性實驗 色譜方法如下，流動相：甲醇0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液-三乙胺(48.0∶52.0∶0.5，V/V/V)；檢測波長：290 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。按此色譜條件進行色譜分析，收集6 h后的空白腸灌流液，以此腸灌流液配制不同濃度的PNH標準溶液，經高效液相色譜法(HPLC)測定。

1.3.2標準曲線的制備 精密稱取PNH對照品3.2 mg，純水溶解，置于25 mL容量瓶中，用K-R緩沖液定容，得PNH對照品儲備液。以儲備液配制濃度為1、2、4、6、8、10、15 μg/mL的對照品溶液，經HPLC法測定。

1.3.3管路的物理吸附性考察 配制含PNH約15 μg/mL的循環液50 mL，連接好循環管路，考察120 min管路對PNH的吸附。于0、30、60、90、120 min取樣，照“1.3.1”項下方法測定。

1.3.4精密度 按“1.3.2”項下操作方法，制備3批濃度分別為2、10、15 μg/mL(每個濃度5份)的對照循環液，依“1.3.1”項方法測定，分別計算批內、批間精密度。

1.3.5穩定性考察 用空白腸灌流液配制15 μg/mL的PNH溶液3份,37 ℃水浴孵育6 h，分別于1、2、3、4、6 h取樣，進行HPLC分析，比較放置前后峰面積。

1.3.6方法回收率的測定 精密稱取干燥至恒重的PNH適量，用水溶解、定容至100 mL，精密吸取1.0 mL，用空白腸灌流液稀釋，進行HPLC分析，經回歸方程求得濃度，計算回收率。使用低、中、高3種濃度的PNH溶液，考察在空白腸灌流液存在下藥物的回收率。

以上公式中：Qin和Qout分別為腸道進出口灌流液的體積(mL)，假定進出口灌流液密度為1.0g/mL；l和r分別為被灌流腸段的長度(cm)和橫截面半徑(cm)，Q為灌流速度(-0.25mL/min)，t為灌流時間(～0.25h)；V為灌流腸段的體積，實驗時間共105min。

1.3.8大鼠在體腸單向灌流法[4]實驗前先用供試液對管路進行循環飽和，以消除管路對藥物的吸附影響。實驗時取自由飲水禁食12h的SD大鼠，腹腔注射20％烏拉坦注射液(1.0g/kg)。麻醉后，將大鼠固定，保持體溫，沿腹中線打開腹腔，分別截取約10cm待考察腸段，于兩端剪切后插管，入口處的插管與蠕動泵連接，結扎。將傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕，并置于紅外燈下保溫。用37 ℃的生理鹽水將小腸內容物沖洗干凈后，即在進口處用已知質量小瓶內裝有的供試液灌流，流速為0.25mL/min，每隔15min在出口處用另一已知質量的小瓶收集灌流液，然后迅速更換下一組供試液小瓶和收集液小瓶，并稱量置換出的供試液小瓶和收集液小瓶的質量，105min后實驗結束。將大鼠處死，剪下被灌流腸段，測量其長度和內徑。本研究分別選取十二指腸、空腸、回腸和結腸進行考察，根據公式1和2計算藥物在不同腸段的吸收速率常數和表觀吸收系數。(1)濃度對腸吸收的影響：以十二指腸為例，分別配制了濃度為5、10、15μg/mL的PNH溶液，考察了不同濃度藥液對PNH的腸吸收情況。(2)pH值對藥物吸收的影響：以十二指腸為例，分別配制了pH值為5.4、6.8和7.4的藥液，考察了不同pH值藥液對PNH的腸吸收情況。

2 結 果

2.1系統適用性實驗 在本色譜條件下，空白腸灌流液不干擾PNH的測定，藥物的保留時間約為4.5min,見圖1。

2.2標準曲線的制備 在1～15μg/mL濃度范圍PNH液的濃度(C)與色譜峰面積(A)呈良好的線性關系，其線性回歸方程為C=25 960A+8 735.1(r=0.999 4，n =7)，見圖2。

2.3管路的物理吸附性考察 管路對PNH無吸附作用,見表1。

a：空白腸液；b：藥物在空白腸液中的色譜圖；c：藥物在體腸吸收試驗中的色譜圖。

圖2 PNH在腸灌流液中的標準曲線(n=7)

表1器械物理吸附考察結果

時間(min)0306090120A(C=15μg/mL)367543347926376364357519367467

精密度=3.4％。

表2 穩定性試驗結果(n=3)

表3 回收率試驗結果(n=15)

2.4精密度 低(2 μg/mL)、中(10 μg/mL)、高(15 μg/mL)3個濃度的批內精密度分別為1.33％、1.46％和1.57％(n=5)，批間精密度分別為1.38％、1.79％和2.01％(n=3)。

2.5穩定性試驗 PNH在Krebs-Ringer液中穩定性良好，PNH在灌流液中6 h內測定是穩定的,見表2。

2.6方法回收率的測定 方法回收率符合要求，見表3。

2.7大鼠在體腸單向灌流法 通過大鼠各腸段部位藥物吸收的研究表明，各腸段對PNH均具有較大的表觀吸收系數和藥物吸收速率常數。各腸段與十二指腸段藥物吸收速率常數之間差異有統計學意義(P<0.05)；表觀吸收系數各腸段間差異無統計學意義(P>0.05)。說明PNH在全腸道吸收較好,見表4。

2.7.1濃度對腸吸收的影響 結果顯示PNH的濃度在考察范圍內對Ka和Papp無明顯影響，差異無統計學意義(P>0.05)。表明PNH在十二指腸段的吸收無自身濃度抑制作用，表明PNH主要以被動擴散機制吸收入體循環[5],見表5。

2.7.2pH值對藥物吸收的影響 數據說明在考察范圍內的不同pH值對Ka和Papp無明顯影響，差異無統計學意義(P>0.05),見表6。

表4 PNH腸道不同部位吸收結果(n=5)

表5 不同濃度對PNH十二指腸吸收的影響

表6 不同pH對PNH十二指腸吸收的影響

3 討 論

3.1藥物試驗模型的選擇 目前，以動物試驗模型評價藥物腸吸收的方法有離體法、在體法和體內法等多種方法[6-11],本研究采用在體法模擬口服給藥后體內吸收的腸道環境，以“單向灌流”的方式考察藥物在大鼠各個腸段的吸收情況。由于在體腸單向灌流實驗中各腸段同時存在有水分吸收，因此引入重量法進行灌流液的體積校正。與傳統的酚紅法比較，重量法通過比較試驗后收集瓶和試驗前供試液瓶的重量差異，直接真實地反映腸道水分吸收情況，而且本法只需測定被檢測藥物濃度，沒有灌流液“體積標示物”的測定干擾。有研究表明，灌流液“體積標示物”酚紅存在一定程度的腸吸收，可能干擾某些化合物的腸道轉運或分析測定[12-13]。此外，本方法對分析檢測儀器的要求相對較低，藥物分析方法的建立相對簡單易行，檢測時間縮短，檢測費用降低。重量法也有一定的局限性。本實驗設定灌流液密度為1 g/mL,由于在單向灌流試驗中腸壁溶蝕或黏膜細胞脫落會增加灌流液黏度，改變其密度。因此在采用重量法研究大鼠單向灌流在體腸吸收情況時應注意修正灌流液密度，盡量減小誤差。

3.2藥物吸收機制初步研究 本研究結果表明，PNH的濃度和pH值在考察范圍內對藥物的腸吸收沒有影響，在考察濃度范圍內，Ka值差異無統計學意義，PNH的吸收機制為被動擴散。根據文獻報道，大鼠的表觀滲透系數Papp<0.03×10-4cm/s時，藥物難以吸收；Papp>0.2×10-4cm/s時，藥物易于吸收[6]。PNH在十二指腸、空腸、回腸、結腸中的Papp分別為3.05×10-4cm/s、2.15×10-4cm/s、1.98×10-4cm/s、2.08×10-4cm/s，提示PNH在十二指腸和小腸全腸段的吸收良好。

3.3對劑型設計的指導意義 本研究對大鼠在體腸吸收的研究結果，為PNH劑型設計提供了依據。該藥在全腸道吸收良好，為被動吸收機制，根據高血壓治療中平穩降壓的治療原則，考慮可將PNH制成緩釋制劑或以零級釋放速率為特征的控釋制劑，實現藥物的緩慢恒速釋放，可延長藥物作用時間，提高藥物治療效果。

[1]Delgado MJ,Nogales F,Ojeda ML,et al.Effect of dietary selenite on development and intestinal absorption in offspring rats[J].Life Sciences,2011,88(3/4):150-155.

[2]聶淑芳,潘衛三,楊星鋼,等.對大鼠在體腸單向灌流技術中重量法的評價[J].中國新藥雜志,2005,9(10):1176-1179.

[3]張莉,陳大為,李芳久,等.法莫替丁大鼠在體小腸吸收動力學研究[J].沈陽藥科大學學報,2001,18(3):170-172.

[4]Sun MH,Zhai XZ,Xue K,et al.Intestinal absorption and intestinal lymphatic transport of sirolimus from self-microemulsifying drug delivery systems assessed using the single-pass intestinal perfusion(SPIP) technique and a chylomicron flow blocking approach:Linear correlation with oral bioavailabilities in rats[J].Eur J Pharm Sci,2011,43(3):132-140.

[5]Linnankoski J,Ranta VP,Yliperttula M,et al.Passive oral drug absorption can be predicted more reliably by experimental than computational models-Fact or myth[J].Eur J Pharm Sci,2008,34(2/3):129-139.

[6]Fagerholm M,Johansson M,Lennernas H.Comparsion between permeability coefficients in rat and human jejunum[J].Pharm Res,1996,13(9):1336-1342.

[7]Pascal LC,Gilles D,Francois C,et al.Influence of hydroxypropyl-β-cyclodextrin and dimethyl-β-cyclodextrin on diphenhydramine intestinal absorption in a rat in situ model[J].Int J Pharm,1998,169:221-228.

[8]Lennernas H,Fagerholm M,Raab Y,et al.Reginal rectal perfusion,a new in vivo approach to study rectal drug absorption in man[J].Pharm Res,1995,12(3):426-432.

[9]劉璐,崔景斌,方洪壯.替硝唑大鼠小腸吸收的研究[J].中國醫院藥學雜志,2003,23(1):4-6.

[10]張向榮,潘衛三.丹參酚酸A在大鼠小腸的吸收動力學研究[J].沈陽藥科大學學報,2002,19(1):14-17.

[11]Poelma FG,Tukker JJ.Evaluation of the chronically isolated intrajejunal loop in the rat for the study of drug absorption kinetics[J].J Pharm Sci,1987,76(6):433-436.

[12]Pieter At,Joachim BS,Ann B,et al.Ex vivo permeability experiments in excised rat intestinal tissue and in vitro solubility measurements in aspirated human intestinal fluids support age-dependent oral drug absorption[J].Eur J Pharm Sci,2010,39(1/3):15-22.

[13]Usach I,Peris J.Bioavailability of nevirapine in rats after oral and subcutaneous administration,in vivo absorption from gastrointestinal segments and effect of bile on its absorption from duodenum[J].Int J Pharm,2011,419(1/2):186-191.