線粒體D－環區單核苷酸多態性與食管癌患者預后關系的研究

范海燕，楊華，李勝棉，郭占軍

線粒體D－環區單核苷酸多態性與食管癌患者預后關系的研究

范海燕，楊華，李勝棉，郭占軍

目的探討線粒體D－環區(D－loop區)單核苷酸多態性與食管癌患者預后的關系。方法選擇2003—2004年在河北醫科大學第四醫院胸外科住院行食管癌根治性手術切除的食管癌患者55例，采用聚合酶鏈反應對其手術切除標本進行線粒體D－loop區測序。通過電話對患者進行隨訪并計算5年生存率，分析其與患者臨床特征的關系。參照基因數據庫AC_000021號從已完成的食管癌患者線粒體D－loop區1 000 bp序列中找出單核苷酸多態性位點，分析不同單核苷酸多態性位點與患者5年生存率的關系。結果本組55例患者均完成了5年的隨訪，共生存20例。不同性別、年齡(以55歲為界)及有無淋巴結轉移食管癌患者5年生存率比較，差異均無統計學意義(P＞0.05);不同TNM分期食管癌患者5年生存率比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。共找出88個單核苷酸多態性位點，采用Kaplan－Meier方法繪制生存曲線發現，僅16278和16399位點與食管癌患者的生存期有關。16278T型食管癌患者與16278C型患者、16399G型食管癌患者與16399A型患者5年生存率比較，差異均有統計學意義(χ2值分別為9.413和11.225，P＜0.05)。采用Cox比例風險回歸模型分析發現，16278T/C〔OR=3.638，95%CI(1.191，11.111)〕和16399G/A〔OR=5.096，95%CI(1.647，15.769)〕是食管癌患者預后的獨立預測因子(P＜0.05)。結論線粒體D－loop區單核苷酸多態性可作為食管癌患者預后的預測因子，有助于早期判斷食管癌患者預后，更好地指導臨床治療，對估計生存期較短的術后患者可給予更積極的輔助治療，以提高患者生存率。

多態性，單核苷酸;線粒體DNA;食管鱗狀細胞癌;預后

食管癌是常見的惡性腫瘤之一，我國北方地區為食管癌高發區，年發病率＞125/100 000，累積病死率男性約為20%，女性約為25%［1］。盡管近年來食管癌的診斷和治療有了長足發展，但由于其侵襲性較高，患者的預后仍較差。研究發現，患者的一般狀況、TNM分期和局部淋巴結轉移等是食管癌患者預后的預測因子;一些分子機制的改變如P53基因突變和核因子κB(NF－κB)表達水平也可能影響食管癌患者的預后［2］。

線粒體DNA(mtNDA)處在活性氧自由基和其他自由基包圍之中，缺乏組蛋白保護，且其內部缺乏完整的修復系統，與核內基因相比，mtDNA較容易發生突變［3］。線粒體D－環區(D－loop區)由1 122 bp組成(核苷酸16024－16569位點和1－576位點)，含有復制起始點和轉錄啟動子，多種腫瘤細胞中存在mtDNA廣泛變異，近年來包括食管癌在內的多種腫瘤細胞中線粒體D－loop區已成為基因突變和多態性研究的熱點［4－5］。本研究旨在探討線粒體D－loop區單核苷酸多態性(SNPs)與食管癌患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2003—2004年河北醫科大學第四醫院胸外科住院行食管癌根治性手術切除的食管癌患者55例，其中男34例，女21例;年齡39～76歲，平均(59.3±8.6)歲;患者ECOG評分(美國東部腫瘤協作組Eastern Cooperative Oncology Group制定的腫瘤活動狀態評分)均為0分，術前均未進行任何臨床藥物治療及放、化療;患者均來自中國河北省食管癌高發地區，術后腫瘤切除標本經病理學檢查證實均為鱗狀細胞癌。

1.2 檢測方法患者術前均空腹抽取外周靜脈血，當天提取線粒體后置于－80℃恒溫冰箱保存。采用聚合酶鏈反應(PCR)法提取mtDNA，全血mtDNA萃取試劑盒由美國Madison生產。迅速擴增mtDNA的D－loop區，擴增上游引物為5'－C CCCATGCTTACAAGCAAGT－3'，下游引物為5'－GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC－3'，長度為1 000 bp，擴增參數按照劑盒說明。使用美國ABI PRISM 3100 DNA序列分析儀將PCR擴增產物純化測序，同一標本采用雙向重復測序。

1.3 觀察指標通過電話對患者進行隨訪并計算5年生存率，分析其與患者臨床特征的關系。參照基因數據庫AC_000021號從已完成的食管癌患者線粒體D－loop區1 000 bps序列中找出SNPs位點，分析不同SNPs位點與患者5年生存率的關系。

1.4 統計學方法應用SPSS 11.5統計學軟件進行分析，采用Kaplan－Meier方法繪制生存曲線，組間比較采用log－rank檢驗;采用Cox比例風險回歸模型進行多因素分析，以相對危險度(OR)及其95%可信區間(95%CI)表示;以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 食管癌患者臨床特征與5年生存率的關系本組55例患者均完成了5年的隨訪，共生存20例。不同性別、年齡(以55歲為界)及有無淋巴結轉移食管癌患者5年生存率比較，差異均無統計學意義(P＞0.05);不同TNM分期食管癌患者5年生存率比較，差異有統計學意義(P＜0.05，見表1)。

表1 食管癌患者臨床特征與5年生存率的關系(n=55)Table 1 Relationship between clinical characteristics and 5－year survival rate in ESCC patients

2.2 線粒體D－loop區SNPs與患者5年生存率的關系共找出88個SNPs位點，繪制生存曲線發現，僅16278和16399位點與食管癌患者的生存期有關。16278T型食管癌患者與16278C型患者、16399G型食管癌患者與16399A型患者5年生存率比較，差異均有統計學意義(χ2值分別為9.413和11.225，P＜0.05，見圖1、2)。

圖1 多態位點16278CC與TT基因型患者5年生存率比較Figure 1 Comparison of 5－year survival rate between the patients with 16278CC or TT allele

圖2 多態位點16399AA與GG基因型患者生存期比較Figure 2 Comparison of 5－year survival rate between the patients with 16399AA or GG allele

2.3 多因素分析采用Cox比例風險回歸模型分析TNM分期，16278T/C、16399G/A基因型與患者5年生存率的關系，結果發現，16278T/C、16399G/A是食管癌患者預后的獨立預測因子(P＜0.05，見表2)。

表2 食管癌患者Cox比例風險回歸模型5年生存率多因素分析Table 2 Multivariate analysis of prognostic factors associated with 5－year survival rate in ESCC patients by Cox proportional hazards model

3 討論

mtDNA是哺乳動物細胞內惟一的核外遺傳物質。1981年Anderson等首次在《Nature》雜志上公布了人類mtDNA基因組的全部核苷酸序列，并繪制了詳細的功能圖譜。研究表明，mtDNA氧化損傷可能與人類衰老、神經退行性疾病、糖尿病以及腫瘤等疾病的發生有關［6］。近年來研究發現，很多實體惡性腫瘤存在高頻率的mtDNA突變。D－loop區是mtDNA的非編碼區，是mtDNA轉錄調控位點。對頭頸部腫瘤、膀胱癌、乳腺癌等進行的研究發現，D－loop區是mtDNA突變的熱點區域［7］。SNPs是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，已成為繼限制性片斷長度多態性(RFLP)標志和微衛星標志后的第三代遺傳標志，其在多基因疾病的易感基因研究領域應用較廣。線粒體D－loop區SNPs位點與多種腫瘤的致癌風險和疾病預后有關［8－9］。

本研究結果發現，16278T型食管癌患者5年生存率低于16278C型患者，16399G型食管癌患者5年生存率低于16399A型患者;16278C/T和16399A/G基因型與食管癌患者預后相關，是食管癌患者預后獨立的預測因子。16278T基因型患者死亡風險是16278C基因患者3.638倍，16399G基因型患者死亡風險是16399A基因型患者的5.096倍。提示mtDNA D－loop區含有這兩個基因型多肽位點者有罹患食管癌的傾向，預后可能更差。

線粒體D－loop區在線粒體基因復制和表達過程中起著重要作用，這個區域的基因突變有可能影響mtDNA復制并導致氧化呼吸鏈的改變，導致大量活性氧自由基釋放而損傷細胞核基因組，在腫瘤的發生、發展過程中起重要作用［10－11］。SNPs位點16278和16399位于線粒體D－loop高變區1(HV1)，此序列具有高突變率，但其具體作用機制尚未明確［12］，可能是使線粒體基因組轉錄發生改變，導致大量活性氧自由基產生，而氧自由基調節機制異常促進腫瘤的發生、發展，進而影響患者的預后。本研究同時發現，食管癌患者的性別、年齡、有無有淋巴結轉移與其5年生存率無關，而TNM分期與5年生存率有關，但性別、年齡、有無淋巴結轉移與患者生存時間的關系都顯示有差異趨勢，可能與本研究樣本量較小、觀察時間較短有關，有待進一步增加樣本量，延長隨訪時間進行深入研究。

總之，線粒體D－loop區SNPs可作為食管癌患者預后的預測因子，有助于早期判斷食管癌患者預后，更好地指導臨床治療，對估計生存期較短的術后患者可給予更積極的輔助治療，以提高患者生存率。長遠來看，應建立以mtDNA D－loop序列的SNPs分析為平臺的食管癌預后評價系統，并推廣應用于其他消化道惡性腫瘤分子研究。

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9 Wang L，McDonnell SK，Hebbring SJ，et al.Polymorphisms in mitochondrial genes and prostate cancer risk［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008，17(12):3558－3566.

10 Suzuki M，Toyooka S，Miyajima K，et al.Alterations in the mitochondrial displacement loop in lung cancers［J］．Clin Cancer Res，2003，9(15):5636－5641.

11 Richard SM，Bailliet G，Paez GL，et al.Nuclear and mitochondrial genome instability in human breast cancer［J］．Cancer Res，2000，60(15):4231－4237.

12 Stoneking M.Hypervariable sites in the mtDNA control region are mutational hotspots［J］．Am J Hum Genet，2000，67(4):1029－1032.

Relationship between Single Nucleotide Polymorphisms in Mitochondrial Displacement－loop and Prognosis of Esophage-al Squamous Cell Car

FAN Hai－yan，YANG－hua，LI Sheng－mian，et al.Department of Gastroenterology and Hepatology，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China

ObjectiveTo study the relationship between single nucleotide polymorphisms(SNPs)in mitochondrial DNA(mtDNA)displacement－loop(D－loop)region and prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma(ESCC).Methods55 ESCC patients underwent radical operation in department of thoracic surgery of the Fourth Hospital of Hebei Medical University from 2003 to 2004 were selected.The D－loop region of mtDNA was sequenced by using polymerase chain reaction method.The patients were followed up by telephone for five years，and then the five year survival rate was calculated and its relationship with clinical features was analyzed.AC_000021 database was referred to in order to find SNPs from the 1 000－bp mitochondria D－Loop region，and the relationship between SNPs and five year survival rate was analyzed.ResultsAll the 55 patients completed the five－year following up and 20 cases survived.The survival rate between patients with different sex，age(55 as dividing line)and whether there was lymphatic metastasis or not showed no statistically significant differences(P＞0.05).The five－year survival rate between patients with different TNM staging showed statistically significant difference(P＜0.05).88 SNPs sites were detected in the 1 000－bp mitochondria D－Loop region.When drawing the survival curves with Kaplan－Meier method，only SNP sites of nucleotides 16278C/T and 16399A/G showed correlation with the survival of patients.The five－year survival rate between patients with 16278T and 16278C and patients with 16399G and 16399A both showed statistically significant differences(χ2=9.413 and 11.225，P＜0.05).Cox proportional hazards regression models showed that 16278T/C〔OR=3.638，95%CI(1.191，11.111)〕and 16399G/A〔OR=5.096，95%CI(1.647，15.769)〕were independent risk factors for the prognosis of ESCC patients.ConclusionSNPs in the D－loop are independent prognostic factors for patients with ESCC and it is conducive to the early prediction of the prognosis of ESCC patients.Positive adjuvant therapy should be performed on patients with estimated shorter survival to improve their survival rate.

Polymorphism，single nucleotide;Mitochondrial DNA;Esophageal squamous cell carcinoma;Prognosis

R 735.1

A

1007－9572(2012)11－3839－03

10.3969/j.issn.1007－9572.2012.11.090

050011河北省石家莊市，河北醫科大學第四醫院消化內科

郭占軍，050011河北省石家莊市，河北醫科大學第四醫院消化內科;E－mail:zjguo5886@yahoo.com.cn

2012－06－10:

2012－09－21)

(本文編輯:鹿飛飛)