揮發性有機物混合物對人支氣管上皮細胞系轉化及染色體穩定性的影響研究

張桂芝，劉長庭，熊瑋，劉東山

揮發性有機物混合物對人支氣管上皮細胞系轉化及染色體穩定性的影響研究

張桂芝，劉長庭，熊瑋，劉東山

目的為探討化學混合物聯合致癌的機制，揭示惡性轉化與染色體不穩定性之間的關系，本研究觀察了揮發性有機物(VOC)混合物(以VOCs表示)對人支氣管上皮細胞系BEAS－2B轉化和染色體穩定性的影響。方法用VOCs作為誘導劑，以液體染毒后測定BEAS－2B細胞的半數致死量(LC50)，以低劑量(8%LC50)對BEAS－2B細胞進行誘導，獲得誘導細胞。觀察細胞生長特性改變并篩選誘導克隆，然后用細胞遺傳學方法(G帶染色法)觀察誘導細胞染色體畸變情況。結果BEAS－2B細胞在VOCs作用后細胞逐漸變大、變圓，細胞質豐富，并伴有多角形或不規則形;核嗜堿深染，體積增大，核仁增多;細胞復層生長，排列紊亂，細胞克隆為無序的條索狀團塊狀排列。經VOCs誘導后細胞倍增時間〔(1.79±0.02)d〕較對照細胞〔(2.08±0.03)d〕縮短，而飽和密度〔(529.1±31.6)×104/ml〕、最大增殖倍數〔(104.8±6.2)倍〕均高于對照細胞〔(321.2±13.1)×104/ml和(54.6±5.4)倍〕，差異均有統計學意義(P＜0.01)。VOCs誘導細胞第15代可在軟瓊脂培養基內形成典型的甚至肉眼可見的陽性細胞克隆，克隆形成率(35.02±7.80)%高于對照細胞(0.13±0.05)%，差異有統計學意義(P＜0.01)。對照細胞與誘導細胞的染色體核型分布比較，差異有統計學意義(P＜0.01);誘導細胞中二倍體(2n=46)比例降低，出現了一定數量的非整倍體(77條、80條染色體)、大量亞二倍體(＜2n)、超二倍體(＞2n＆＜4n)和多倍體(≥4n)細胞，其非穩定性畸變頻率(67%)高于對照細胞(4%)，差異有統計學意義(P＜0.01)。結論VOCs可使BEAS－2B細胞發生轉化，并影響細胞染色體的穩定性，使其發生畸變并向惡性化方向發展。

揮發性有機物;人支氣管上皮細胞;染色體不穩定性

室內空氣污染已成為世界各國廣泛關注的問題，被公認為人類健康最危險的殺手之一。在對室內空氣的檢測中，共發現30多種揮發性有機物(volatile organic compound，VOC)，某些有害氣體濃度比室外高出10倍甚至幾十倍，其中致癌物質、致病病毒有20多種。室內VOC大多來自建筑材料、結構材料、裝飾材料等，其中甲醛、苯、甲苯和二甲苯是較常見的室內VOC［1－2］。室內VOC污染可持續6個月～1年，有的甚至長達幾年［3］。現已證明長期低濃度接觸VOC會使人體產生全身變態反應，甚至會造成居室人員患上癌癥［4］。

先期研究發現VOC混合物(以VOCs表示)具有與單個成分不同的化學性質和毒性特征，高劑量時呈現細胞致死效應，較低劑量時呈現一種細胞轉化效應［5］。為探討VOCs慢性聯合作用，本研究選取裝修材料中常見的12種VOC組成混合物，觀察其作用于人支氣管上皮細胞后細胞生長特性及染色體穩定性的改變，以探討VOCs對細胞轉化的機制，揭示染色體不穩定性與化學聯合致癌之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞永生化人支氣管上皮細胞系(BEAS－2B)，為軍事醫學科學院二所保存細胞株，染色體核型為近二倍體。細胞株含SV40 DNA，表達T抗原，但不含腺病毒DNA。細胞以LHC－8無血清培養液(LHC－8 SERUM－FREE MEDIUM with GLUTAMINE)培養，接種于25 cm2或75 cm2的培養瓶內，在95%相對濕度、5%二氧化碳(CO2)、37℃培養箱內孵育，每周傳代1次，傳代后3 d換液。

1.1.2 試劑誘導劑VOCs由苯、甲苯、二甲苯等12種有機物等體積組成，各試劑均為分析純，由北京化學試劑公司生產。BEAS－2B細胞(美國ATCC細胞庫);碘化丙啶(美國Sigma－Aldrich公司);LHC－8無血清培養液(美國Biofluids INC公司);LHC基礎培養液(美國Biofluids Biobource INC公司);噻唑蘭(MTT，美國Amersham LIFE SCIENCE公司);6－硫鳥嘌呤(6－TG，美國Sigma公司);F－12培養基(F－12，美國GIBCO公司);胰蛋白酶(Try，美國GIBCO公司);胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術研究所);瓊脂糖(美國Promega公司);乙二胺四乙酸二納(EDTA－Na2，美國Sigma公司);細胞松弛素B(美國Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司);其他試劑為進口或國產分析純。

染毒液配置:1.0 ml VOCs與100%乙醇以1∶1混合，再以LHC－8無血清培養液稀釋1 000倍至所需濃度。乙醇的最終濃度不超過0.1%，以免影響培養細胞的正常生理生化功能。

1.2 方法

1.2.1 細胞染毒劑量的篩選(MTT法)采用MTT法確定BEAS－2B細胞對測試毒物VOCs的敏感性，并以細胞存活率計算出VOCs的半數致死量(LC50)。按司徒鎮強等［6］方法進行操作，結果以細胞存活率對劑量作圖，求出LC50值。

1.2.2 細胞轉化和克隆篩選VOCs對細胞進行低劑量(8%LC50)染毒24 h后，D－hanks液洗滌3次，加入4 ml LHC－8無血清培養液繼續培養至存活細胞形成克隆，用胰酶消化收集細胞并轉入新的培養瓶，此為染毒轉化第1代細胞。然后每2 d換液1次，穩定后改為1次/3 d，每6 d傳代1次，每次接種1×105個細胞連續傳代培養。嚴密觀察細胞生長變化，并驗證相關的生物學特性后確定為誘導細胞，以未染毒的BEAS－2B細胞作為對照細胞。

1.2.3 細胞生長曲線測定常規消化第10代誘導細胞及其對照細胞，制成細胞懸液后以5×104/皿分別接種于21～35個含3 ml 37℃預溫LHC－8無血清培養液的60 mm培養皿中，各組每24 h取3皿進行細胞計數并計算均值，按時給未計數的細胞換液。計數持續到對照細胞出現明顯密度抑制為止。以時間為橫軸，細胞數為縱軸(指數)，繪制生長曲線。按下列公式計算細胞倍增時間(doubling time，DT):DT=t×〔log2/(logNt－logN0)〕，其中t代表培養時間，N0及Nt分別代表接種后及培養t小時后的細胞數;同時，計數穩定期細胞數，計算單位體積的細胞均數，即細胞生長飽和密度。

1.2.4 半固體克隆形成實驗用LHC基礎培養液配制1.4%的備用瓊脂糖，高溫高壓滅菌后放入39℃水浴中保溫，用預溫的LHC－8無血清培養液稀釋為0.7%瓊脂糖。以3 ml/皿倒入60 mm帶格培養皿中，鋪制底層、凝固后備用。常規消化收集第15代誘導細胞及對照細胞，與0.7%瓊脂糖1∶1混勻稀釋為0.35%細胞瓊脂混合液，加到培養皿中0.7%瓊脂糖凝膠上(細胞濃度為1×104/皿)，凝固后每皿加入2 ml LHC－8無血清培養液，每組5皿，靜置培養。每3 d換液1次，4周后鏡下計數直徑＞75 μm或細胞多于50個的克隆數，按下列公式計算克隆形成率:克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%;同時，挑取陽性細胞克隆繼續培養后進行染色體分析。

1.2.5 細胞染色體標本的制備培養細胞50%～60%融合時，加入秋水仙素(終濃度0.03 g/L)，繼續培養3 h，Gibco trypsin－EDTA消化液消化部分細胞脫壁，加入1/20體積的Gibco胎牛血清終止消化，離心得到細胞沉淀;細胞沉淀經低滲、預固定、固定、二次固定后制備成細胞懸液，懸液滴于冷凍的潔凈載玻璃片上，文火烘干制備染色體標本片，經37℃，5～7 d老化，以0.02%胰蛋白酶消化10～15 s，吉姆薩染色。

1.2.6 染色體鏡檢分析方法低倍鏡下(10×10)選擇染色體分散良好、長短適宜、著色均勻的中期分裂相。油鏡下每株細胞觀察50～100個中期分裂細胞，計數染色體數目。染色體結構分析:觀察25個中期分裂細胞，選取至少10個具有畸變共性的細胞進行顯微攝影。照片沖洗放大后，參照人標準核型進行核型分析。

1.3 統計學方法采用SPSS 13.0分析軟件，計量資料以(±s)表示，組間比較采用t檢驗;VOCs LC50分別以作圖法進行計算，同時采用概率單位法(PROBIT)進行驗證;其他數據依據其性質分別采用計數資料的χ2檢驗或非參數檢驗的秩和檢驗進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VOCs細胞染毒劑量的篩選結果由圖1可知，VOCs的LC50為0.82 g/L，PROBIT計算所得LC50為1.10 g/L，經擬和優度的χ2檢驗(Pearson Goodness－of fit Chi Squre)，χ2=912.661，P＜0.01，不接受“對稱S形曲線”的假設，認為可信區間(CI)計算中未使用非齊同因素，95%CI為(0.99，2.05)g/L。本研究以8%LC50(0.068 g/L)作為細胞的誘導劑量，即12.5 μl/ml培養液體系對BEAS－2B細胞進行誘導，待長期培養后篩選陽性克隆用于染色體分析。

2.2 誘導細胞的形態變化光鏡下觀察:正常的BEAS－2B細胞多為梭形，大小均勻，細胞質較少，細胞間連接較緊密;細胞核多呈橢圓形，單個核仁;單層生長，排列有序或放射狀，有明顯接觸抑制和密度抑制(見圖2)。而VOCs誘導細胞體積變大，呈圓形或類圓形，常伴有多角形不規則形，細胞質豐富;核嗜堿深染，核仁1個至數個不等;復層生長，排列不規則，呈現無序團塊狀，無明顯接觸抑制和密度抑制(見圖3)。

2.3 細胞生長特性VOCs作用初期，對照細胞和誘導細胞的生長速度相差不大，誘導細胞自第5天開始生長速度加快，第12天時對照細胞已出現接觸抑制和密度抑制，呈現明顯飽和狀態，細胞已不再增殖，達到細胞培養的最大密度時間，而此時誘導細胞仍可繼續增殖(見圖4);此時，誘導細胞倍增時間、飽和密度及最大增殖倍數與對照細胞比較，差異均有統計學意義(P＜0.01，見表1)。

圖1 混合液中VOCs－MTT細胞存活曲線Figure 1 The suevival curve of BEAS－2B cells induced by VOC mixture

圖3 VOCs誘導細胞(HE染色，10×10)Figure 3 The induced cells by VOCs(HE，10×10)

表1 對照細胞及誘導細胞生長曲線的特性(±s)Table 1 The characters of growth curve of BEAS－2B and induced cells

表1 對照細胞及誘導細胞生長曲線的特性(±s)Table 1 The characters of growth curve of BEAS－2B and induced cells

組別細胞倍增時間(d)飽和密度(×104/ml)最大增殖倍數(倍)2.08±0.03321.2±13.154.6±5.4誘導細胞組1.79±0.02529.1±31.6104.8±6.2 t對照細胞組80.43－61.87－60.41 P值值0.0000.0000.000

2.4 半固體克隆形成率通常情況下，對照細胞(即正常BEAS－2B細胞)不能在半固體瓊脂中生長;而VOCs誘導細胞第15代失去接觸抑制具有錨著獨立性生長能力，能夠在半固體瓊脂中形成集落(見圖5)，其半固體克隆形成率(35.02±7.80)%與對照細胞(0.13±0.05)%比較，差異有統計學意義(t=－44.70，P＜0.01)。

圖4 對照細胞及誘導細胞的生長曲線Figure 4 The growth curves of control BEAS－2B and induced cells

2.5 VOCs誘導細胞染色體核型的變化

2.5.1 染色體數目的變化對照細胞與誘導細胞的染色體核型分布比較，差異有統計學意義(P＜0.01);對照細胞(即正常BEAS－2B細胞)的染色體數目以二倍體核型(2n=46)為主，亞二倍體(＜2n)、多倍體(≥4n)很少，且傳代過程中保持穩定;而誘導細胞二倍體核型比例下降，以超二倍體(＞2n＆＜4n)及多倍體為主，多倍體多見(見表2)。

表2 對照細胞和誘導細胞染色體核型分布情況比較(%)Table 2 The chromosome karyotype ratio of induced cells and control BEAS－2B cells

2.5.2 染色體結構的改變對照細胞代表核型為二倍體(2n=46)，但其5、15、16號染色體各丟失1條染色體，呈單體型狀態，而相同位置各有1條未知染色體分別與各染色單體配對，且這3條染色體在傳代過程中穩定表達，因此將其作為BEAS－2B細胞的標記染色體，分別表示為M1、M2、M3。可見，BEAS－2B細胞是單體型混合配對的假二倍體細胞，其典型核型見圖6。

圖6 對照細胞(正常BEAS－2B細胞)核型2n=46，XY，－5，－15，－16，+M1，+M2，+M3Figure 6 The karyotype of BEAS－2B cell(G－banding)2n=46，XY，－5，－15，－16，+M1，+M2，+M3

圖7 VOCs誘導細胞的多倍體圖像(箭頭示dic/tri)Figure 7 The structural changes of chromosomes of polyploid induced cell(dic，ace)

誘導細胞核型為多倍體，與對照細胞相比有較大變化，出現一定數量的非整倍體(77條、80條染色體)，說明染色體結構發生了明顯的丟失和重排，同時可見數對雙著絲粒(dic)或三著絲粒(tri)染色體(見圖7)。2.5.3 多倍體核型非穩定性畸變對照細胞與誘導細胞非穩定性畸變結果見表3，顯示在所計數的100個細胞中，對照細胞總的非穩定性畸變〔染色體易位(t)和染色體增長(+)〕發生頻數為4%(4/100);誘導細胞總的非穩定性畸變〔dic、tri、ace、環狀染色體(r)、t、+〕發生頻數為67%(67/100)，二者比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

表3 對照細胞和誘導細胞染色體非穩定性畸變發生頻率(%)Table 3 The non－stabilizing chromosome aberration frequency of control BEAS－2B cells and induced cells

3 討論

自從1914年德國科學家Boveri提出惡性細胞存在遺傳不穩定性以來，人類對遺傳不穩定性與腫瘤的關系已有了一定的認識。人類腫瘤細胞中存在兩種類型的基因組不穩定，一種是錯配修復基因突變導致的核苷酸水平的遺傳不穩定性，稱為微衛星不穩定性(microsatellite instability，MIN);另一種是在染色體水平產生的遺傳不穩定性，稱為染色體不穩定性(chromosome instability，CIN)［7］。CIN主要包括染色體結構異常和數目異常。結構異常包括雜合缺失、染色體易位、重排、基因擴增導致的染色體均染區、雙微體等;數目異常主要是非整倍體。CIN是人類實體瘤中常見的現象之一，目前的研究表明其在腫瘤的發生、發展中有重要作用［8］。

本研究發現，永生化的BEAS－2B細胞在VOCs作用后細胞逐漸變大、變圓，細胞質豐富，并伴有多角形或不規則形;核嗜堿深染，體積增大，核仁增多;細胞復層生長，排列紊亂，細胞克隆為無序的條索狀團塊狀排列。經VOCs誘導后細胞生長加快，倍增時間縮短，呈現無限增殖趨勢，無明顯的接觸抑制和密度抑制。誘導細胞轉化后期已具有很強的錨著獨立性生長能力，可在軟瓊脂培養基內形成典型的甚至肉眼可見的陽性細胞克隆，克隆形成率為(35.02±7.80)%，顯著高于對照細胞的(0.13±0.05)%，說明誘導細胞的遺傳性狀發生改變，具備了慢性轉化特性，完成了癌前轉化，極有可能轉化為癌細胞。因為能在軟瓊脂介質中形成克隆標志著細胞發生惡性轉化。

造成染色體不穩定的染色體數量變化通常是有絲分裂過程中染色體錯誤分離的結果。本研究染色體分析發現，誘導細胞中二倍體(2n=46)比例顯著降低，出現了一定數量的非整倍體(77條、80條染色體)、大量亞二倍體(＜2n)、超二倍體(＞2n＆＜4n)和多倍體(≥4n)細胞;而誘導細胞則以多倍體最為突出。這種染色體眾數(modal number)由二倍體向近二倍體、非整倍體、多倍體轉化的趨勢，代表著細胞增殖失控、核分裂加速，染色體復制過程錯誤率升高，核漿分裂失衡等增生細胞的特性;同時多倍體細胞群體的形成與誘導細胞全面惡性表型和致瘤性的獲得，與細胞轉化啟動、增殖分化失控和多倍體克隆的急劇擴增有直接關系。非穩定性畸變作為非平衡的互換畸變，其直接后果是引起細胞死亡。誘導細胞有大量非穩定性畸變(dic、tri、ace、r、t、+)，其非穩定性畸變頻率為67%，顯著高于對照細胞的4%。說明攜帶有非穩定性畸變的細胞在傳代選擇過程中不僅未失去分裂增殖能力，反而獲得了明顯的生長優勢。這表明在長期低濃度VOCs存在時，支氣管上皮細胞系染色體不穩定性逐漸增加，易發生各類畸變并向惡性化方向轉化，可能導致腫瘤發生。有研究表明細胞染色體畸變率與肺癌臨床分期密切相關［9］，染色體畸變分析有望作為臨床肺癌診斷及分期判斷的一項有意義的實驗室檢查手段。

雖然多項研究表明發生于體外細胞的癌變過程中，細胞遺傳學的改變與體內細胞癌變歷程中染色體的異常非常接近，分析誘導細胞的染色體核型將有助于了解機體細胞癌變過程中所發生的細胞遺傳學改變;但化學致癌過程畢竟是以細胞生長和分化逐步失控，歷經啟動(initation)、促進(promotion)和演進(progression)各階段的多步驟過程。本研究所得的體外環境下VOCs對BEAS－2B細胞誘導研究，一方面可以作為下一步研究基因、蛋白水平致癌機制的啟示;另一方面，還要充分考慮VOCs與人體正常支氣管上皮細胞實際的作用機制及其相應的毒性機制。今后研究中在探討細胞毒性作用機制的同時，必須結合動物毒理學研究和人群流行病學結果，這樣才能真正揭示化學混合物(如VOCs)對機體細胞的化學致癌機制。

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5 劉東山，張桂芝，金銀龍.揮發性有機物(VOCs)對永生化支氣管上皮細胞(BEAS－2B)急性毒性［J］．首都醫科大學學報，2005，26(6):662－666.

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9 熊瑋，黃桂君，錢桂生，等.肺癌染色體畸變分析［J］．重慶醫學，2002，31(9):776－777.

Study of the Effect of Volatile Organic Compounds on the Transformation and Chromosomal Instability of Human Bron-chial Epithelial

ZHANG Gui－zhi，LIU Chang－ting，XIONG Wei，et al.Department of Respiratory Diseases，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

ObjectiveTo investigate the co－carcinogenic mechanisms of chemical mixtures and reveal the relationship between malignant transformation and chromosome instability.This study observed the impact of a mixture of volatile organic compounds(VOCs)on the transformation and chromosome stability of human bronchial epithelial cell line BEAS－2B in vitro.MethodsVOCs worked as inducers and were used to determine the median lethal dose of BEAS－2B(LC50)after contamination;BEAS－2B cells were induced by low dose of LC50(8%LC50)and then got the induced cells.The characteristics change of cell growth was observed and the induced clone was filtered，the induction of chromosome aberrations was observed by using cytogeneticMethods(G band staining)then.ResultsAfter VOCs induction，BEAS－2B cells gradually became large and roungded，abundant cytoplasm，accompanied with polygon or irregular shape;the nuclear of the cells were basophilic hyperchromatic，the volume and the nucleoli of the nuclear were increased;the growth of the cells tend to be multi－layered with disordered arrangement，the cell clones arranged disorderly cord－like lumps.The doubling time of VOCs induced cells was significantly shortened compared with that of the control cells〔(1.79±0.02)d VS(2.08±0.03)d〕，the saturation density and the biggest proliferation multiples were significantly higher than those of the control cells〔(529.1±31.6)×104/ml VS(321.2±13.1)×104/ml;(104.8±6.2)times VS(54.6±5.4)times，P＜0.01〕.The 15th generation of VOCs induced cells formed typical even visible positive cell clones on soft agar medium，clone formation rate was significantly higher than that of control cells〔(35.02±7.80)%VS(0.13±0.05)%，P＜0.01〕.The karyotype distributions of control cells and induced cells had statistically significant difference(P＜0.01)．The proportion of the diploid(2n=46)in the induced cells was significantlylower.A certain number of aneuploid〔77，(＞2n＆＜4n)，chromosome 80〕，a large number of hypodiploid(＜2n)，hyperdiploid and polyploid cells(≥4n)appeared;the non－stability chromosome aberration frequency was 67%，accompanied by a large number of non－stability aberrations(dic，tri，ace，r，t，+)which all significantly higher than those of the control cells(P＜0.01).ConclusionVOCs could induce the transformation of BEAS－2B cells;it could also affect the stability of the cell chromosome，cause aberration and make cell transformation to malignization direction.

Volatile organic compounds;Human bronchial epithelial cells;Chromosomal instability

R 394.224

A

1007－9572(2012)11－3861－05

10.3969/j.issn.1007－9572.2012.11.097

100853北京市，中國人民解放軍總醫院南樓呼吸科(張桂芝，劉長庭);第三軍醫大學西南醫院呼吸科(熊瑋);中國疾病預防控制中心公共衛生管理處(劉東山)

劉東山，100050北京市，中國疾病預防控制中心公共衛生管理處;E－mail:martinliuer1204@yahoo.com.cn

2012－08－13;

2012－10－24)

(本文編輯:劉莉)