酸堿處理對酪蛋白源ACE抑制肽穩(wěn)定性影響的研究

鄔威，姜瞻梅

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

酸堿處理對酪蛋白源ACE抑制肽穩(wěn)定性影響的研究

鄔威，姜瞻梅

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

在不同pH值條件下，處理酪蛋白源ACE（血管緊張素轉(zhuǎn)換酶）抑制肽，以ACE抑制活性、游離氨基質(zhì)量濃度以及色差值為檢測指標(biāo)，研究了酸堿處理對ACE抑制肽穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，ACE抑制肽受酸堿度影響較大，pH值為1～8的ACE抑制肽的抑制活性維持在一個較高水平，平均抑制活性達到58.33%，pH值為9～13的樣品抑制活性明顯降低；游離氨基質(zhì)量濃度在中性條件下較高，隨著酸性和堿性條件的增強，其含量逐漸降低；另外，ACE抑制肽在pH＜3和pH＞11條件下，隨酸性和堿性條件的增強，b*值變大，顏色變深。因此，在食品加工貯藏過程中，為使酪蛋白源ACE抑制肽保持活性穩(wěn)定，應(yīng)避免其處于過酸或過堿的加工條件。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶；抑制肽；穩(wěn)定性；酸堿處理

0 引 言

自從1965年Ferreira[1]首次在蝮蛇毒液中發(fā)現(xiàn)ACE（血管緊張素轉(zhuǎn)換酶）抑制肽以來，現(xiàn)已從不同食物蛋白質(zhì)中獲得了各種ACE抑制肽[2-4]。其中，酪蛋白源ACE抑制肽因其安全性高，無毒副作用等優(yōu)點，在高血壓的治療研究中具有重要的實踐價值和研究意義[5-6]。目前，蛋白源ACE抑制肽的制備方法、分離純化鑒定，體內(nèi)功效活性方面的研究日趨成熟，如利用生物酶解技術(shù)[7]，發(fā)酵技術(shù)[8]和基因工程技術(shù)[9]均獲得了不同活性的ACE抑制肽，但在加工貯藏過程中，酪蛋白源ACE抑制肽是否能保持強的抑制活性，未見研究報道。

本研究通過改變不同酸堿條件處理酪蛋白源ACE抑制肽，研究對其抑制活性的影響。這可為制定科學(xué)的生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)制備出有高穩(wěn)定性的ACE抑制肽，提供基本的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白 （乳品科學(xué)教育部重點實驗室自制），β-巰基乙醇、十二烷基磺酸鈉 （SDS）、鄰苯二甲醛（OPA）、L-亮氨酸，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE），馬尿酰組胺酰亮氨酸（HHL），乙腈（色譜純），三氟乙酸（色譜純），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計，AL-104精密電子天平，HH-QS超級恒溫油浴鍋，不銹鋼電熱恒溫水浴鍋，SE-2000型色差計，TU-1800型紫外可見分光光度計，全自動高效液相色譜儀，Pall filtron超濾系統(tǒng)，LGJ-25冷凍干燥機。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白源ACE抑制肽的制備

精確稱取一定量的酪蛋白，用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液將其溶解，置于恒溫水浴鍋中，待反應(yīng)體系溫度達到水解溫度時，加酸（HCl）或堿（NaOH）達到預(yù)定pH值為7，然后加入As.1398中性蛋白酶進行水解，在整個水解過程中用電動攪拌機不斷攪拌，并不斷加入適當(dāng)濃度的NaOH以維持pH值在規(guī)定范圍的±0.05內(nèi)。當(dāng)反應(yīng)6 h后，將反應(yīng)體系在沸水浴中保溫20 min中止反應(yīng)。將水解物在4 000 g離心30 min，取上清液，采用3 ku的超濾膜過濾取透過液，然后將其進行冷凍干燥，即得酪蛋白源ACE抑制肽。

1.3.2 ACE抑制活性的測定

取120 μL馬尿酰組胺酰亮氨酸（HHL）底物液，加入20 μL抑制劑，混合均勻后加入10 μL的ACE酶液充分混合。在37℃條件下保溫60 min后，再加入150 μL濃度為1 mol/L的HCl中止反應(yīng)，并加0.5 mL去離子水，得到反應(yīng)液。該反應(yīng)液用0.45 μm濾膜過濾后在HPLC系統(tǒng)自動進樣分析。同時用20 μL，pH值為8.3的硼酸鹽緩沖液替代抑制劑溶液作為空白對照組。ACE抑制活性計算公式為

式中：M為空白對照樣組中馬尿酸的峰面積；N為添加抑制劑組中馬尿酸的峰面積。

1.3.3 游離氨基的測定

采用鄰苯二甲醛（OPA）方法，參照Guan[10]等人的方法，并略作修改。100 mL OPA試劑含：50 mL濃度為0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液，5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的SDS溶液，2 mL含80 mg OPA的甲醇溶液，200 μL β-巰基乙醇。質(zhì)量濃度為20 g/L的ACE抑制肽樣品50 μL，用去離子水稀釋至600 μL。 取稀釋液100 μL與3 mL配制好的OPA試劑均勻混合，置于室溫黑暗處反應(yīng)，準(zhǔn)確計時5 min，340 nm處測定吸光值。且以L-亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物，按上述方法繪制出亮氨酸濃度與吸光值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各樣品中游離氨基的含量。

1.3.4 顏色的測定

稱取制備好的ACE抑制肽樣品，用去離子水配成質(zhì)量濃度為20 g/L的溶液，使用色差計進行測定，記錄色差計顯示的L*，a*，b*，ΔE*的值； 每個樣品記錄6個讀數(shù)。因樣品的顏色呈黃色，主要用到的即是測定后的b*值（黃度值）。

1.3.5 不同pH值條件下ACE抑制肽樣品的制備

稱取ACE抑制肽樣品，用去離子水配制成質(zhì)量濃度為80 g/L溶液，利用濃度為1 mol/mL的HCl和濃度為1 mol/mL的NaOH調(diào)節(jié)pH值，將其pH值依次調(diào)至1～13。pH值調(diào)節(jié)后，將不同pH值的ACE抑制肽轉(zhuǎn)至具塞試管中，在100℃條件下油浴1 h。油浴反應(yīng)完成后，在真空冷凍干燥條件下，制備出不同pH值條件的ACE抑制肽粉，待檢測分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每個樣品每項指標(biāo)均重復(fù)測定至少3次，數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行方差分析，并用Origin75軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1.1 酸堿處理對ACE抑制肽抑制活性的影響

在100℃的加熱條件下，不同pH值處理酪蛋白源ACE抑制肽1h后，利用高效液相法檢測ACE抑制活性結(jié)果如圖1所示。

圖1中，a,b,c等字母相同則表示差異不顯著，不同則表示差異顯著。Duncan分析，其中P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。下同。

由圖1可以看出，pH值為1～8的酸堿加熱條件處理后的ACE抑制肽樣品，其ACE抑制活性差異不顯著（P＞0.05），pH值為9～12的酸堿加熱條件的樣品，其ACE抑制活性差異也不顯著（P＞0.05）。 pH值為1～8的ACE抑制肽抑制活性維持在一個較高的水平，平均抑制率達到58.33%。且pH值為4條件處理后的樣品抑制活性最高，經(jīng)堿性條件處理后，pH值為9～13的樣品抑制活性明顯降低，并在pH值為13條件下ACE抑制活性下降到最低值。因此想要保持ACE抑制肽抑制活性的穩(wěn)定，應(yīng)控制好pH值條件，避免處于堿性（pH＞9）條件，造成ACE抑制肽抑制活性的損失。

2.1.2 酸堿處理對ACE抑制肽游離氨基質(zhì)量濃度的影響

按照OPA方法檢測游離氨基質(zhì)量濃度，以L-亮氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

L-亮氨酸的質(zhì)量濃度與吸光值的關(guān)系之間的回歸方程為

根據(jù)繪制出的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出質(zhì)量濃度為0.13 g/L的酪蛋白源ACE抑制肽在100℃的加熱條件下，不同pH值處理1 h后游離氨基的質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，pH值為1～2，pH值為4，pH值為8～9酸堿加熱處理后的ACE抑制肽樣品；游離氨基質(zhì)量濃度差異不顯著 （P＞0.05），pH值為5和7處理后的ACE抑制肽樣品的游離氨基質(zhì)量濃度差異也不顯著 （P＞0.05）。 酸性（pH＜6）條件下，ACE抑制肽樣品的游離氨基質(zhì)量濃度呈現(xiàn)較小波動，pH值為3時，質(zhì)量濃度有所升高，pH值為6時分解程度達到最大，形成的游離氨基質(zhì)量濃度最高。堿性（pH＞9）條件下，隨pH值的增大，樣品中游離氨基質(zhì)量濃度降低，pH值為12時達到最低值。由此可知，ACE抑制肽的分解易受pH值影響，pH＜9條件下處理的ACE抑制肽樣品，分解斷裂產(chǎn)生的游離氨基質(zhì)量濃度較高，ACE抑制肽的保留較強活性，pH＞9時分解產(chǎn)生游離氨基的質(zhì)量濃度降低，ACE抑制肽活性受到抑制。

2.1.3 酸堿處理對ACE抑制肽顏色的影響

在100℃的加熱條件下，不同pH值處理酪蛋白源ACE抑制肽1 h后，使用色差計測定其黃度值b*，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，pH值為3，4，6，7酸堿加熱處理后的ACE抑制肽樣品， 黃度值b*差異不顯著 （P＞0.05），pH2、pH9處理后的ACE抑制肽樣品，黃度值b*差異也不顯著（P＞0.05），其余pH值條件處理的樣品均差異顯著（P＜0.05）。 pH值為8時，樣品b*值達到最低，顏色最淺，說明在此條件，肽樣品分解程度低，生成的有色物質(zhì)最少；pH值為5次之，pH值為13時b*值最大，顏色最深，說明ACE抑制肽在此條件下分解最劇烈。從整體趨勢來看，樣品在pH＜3和pH＞11的條件下，隨酸堿度增大，b*值變大，顏色變深。由此可知，ACE抑制肽的酸堿加熱處理后的顏色易受pH值影響，且受堿性條件影響較大。

3 結(jié) 論

酪蛋白源ACE抑制肽的抑制活性，在中性和酸性條件下未發(fā)生改變，但當(dāng)pH＞9時，ACE抑制肽的抑制活性隨pH值增大而下降；在中性條件下，ACE抑制肽的游離氨基質(zhì)量濃度較高，但隨著酸性和堿性條件增強，其游離氨基降低；在中性條件下，ACE抑制肽的顏色較淺，在酸性和堿性條件下顏色較深，經(jīng)pH＞11條件處理后，顏色變化劇烈，并隨pH值增大，顏色加深。

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Study on effects of treatment of heating combined with acid and alkali on the stabilities of angiotensin converting enzyme inhibitory peptide derived from bovine casein

WU Wei,JIANG Zhan-mei
(Food Science&Technology of Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

Effects of different processing and storage conditions on stabilities of angiotensin converting enzyme inhibitory peptide were studied by determining ACE inhibitory activity,free amino group content and color.It was shown that stabilities of ACE inhibitory peptide were easily influenced by pH value.Under the conditions of pH1～pH8,ACE inhibitory activity maintained in a higher level and average inhibition activity reached 58.33%.Meanwhile,there was decrease of ACE inhibitory activity at pH9～pH13.Under the conditions of pH＜3 and pH＞9,free amino group content of ACE inhibitory peptides decreased and their colors turned dark.Consequently,in order to keep the stabilities of ACE inhibitory peptide stable,food processing and storage conditions of pH＜3 or pH＞9 should be avoided.

angiotensin converting enzyme；inhibitory peptide；stability；acid and alkali treatment

Q93-33

A

1001-2230（2012）04-0018-03

2011-11-25

國家自然科學(xué)基金項目(31000801)。

鄔威(1988-)，女，碩士研究生，研究方向為乳品加工與畜產(chǎn)品。

姜瞻梅