牽張微應變對人退變髓核與纖維環細胞增殖的影響*

張曉林 孫曉雷 馬信龍

牽張微應變對人退變髓核與纖維環細胞增殖的影響*

張曉林 孫曉雷 馬信龍△

目的：探討循環牽張微應變對體外培養的人退變髓核與纖維環細胞增殖的影響。方法：人退變椎間盤組織來源于1例29歲腰椎間盤突出癥患者的手術取材，病理學診斷評估其退變程度，無菌條件下酶消化法分別原代培養髓核與纖維環細胞，并對細胞系進行鑒定。將第3代細胞接種于硅橡膠膜載體上，利用EF3200力學試驗儀搭載的BioDynamic生物反應艙系統，對其施加頻率為0.25 Hz，應變為0 με、5萬με、10萬με和15萬με的加載3 h，應用流式細胞儀檢測不同微應變環境下2種細胞的增殖活性。結果：退變髓核與纖維環細胞應力加載后生長狀態良好。隨著微應變的增加，髓核細胞S期細胞比例在10萬με、15萬με時均高于纖維環細胞，差異有統計學意義（P<0.01）；纖維環細胞增殖指數（PI）在各微應變加載組均高于髓核細胞，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：微應變刺激對人退變髓核與纖維環細胞的增殖總體效應是一致的，但相同的微應變刺激對纖維環細胞增殖的促進效應明顯高于髓核細胞。

椎間盤移位 流式細胞術 椎間盤退變 髓核細胞 纖維環細胞 牽張微應變 增殖指數

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration,IVDD）是臨床上腰痛最常見的病理基礎因素[1-2]，但其退變機制涉及體內多重因素的協調與調節過程[3]。近年來生物力學因素在椎間盤退變過程中發揮的調節作用越來越受到關注[4-6]。髓核與纖維環所含基質成分的差異導致其力學特性及力學生物效應均有明顯不同。IVDD的主要病理改變為椎間盤細胞功能的退變及椎間盤基質的成分、結構與功能的改變[7-8]。椎間盤2種不同細胞在退變中所表現出來的差異及原因，對于研究椎間盤退變的機制有著重要的提示意義，本研究在體外細胞水平觀察力學刺激對退變髓核及纖維環細胞的影響，以期為IVDD的預防與治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM培養基、胎牛血清（GIBCO，美國），乙二胺乙酸二鈉（EDTA）、Ⅰ型及Ⅱ型膠原、胰蛋白酶（Sigma，美國），甲苯胺藍溶液（東勝泰博，北京），抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體（武漢博士德），ElectroForce 3200力學實驗儀器、BioDynamic生物反應艙系統（Bose，USA），CO2培養箱（Hera-cell，德國），恒溫搖床（Heidolph，德國），倒置顯微鏡（OLYMPUS，日本），細胞培養板（corning，美國），流式細胞儀（BD，美國）。

1.2 方法

1.2.1 標本取材 人退變椎間盤組織為1例29歲男性腰椎間盤突出癥患者手術標本，從標本髓核與纖維環原有界限、裂隙、纖維束變化及細胞數量與集群等方面對椎間盤退變情況進行分級[9]，取材嚴格無菌操作。

1.2.2 髓核與纖維環細胞原代培養 無菌條件下，清洗剔除脂肪、軟骨組織，分離髓核與纖維環組織，D-Hanks液沖洗3遍，雙抗浸泡3 min，分別以眼科剪剪碎髓核與纖維環組織為約1 mm×1 mm×1 mm大小。髓核組織以0.25%的胰蛋白酶和0.2%的Ⅱ型膠原酶聯合消化，37℃搖床200 r/min，90 min，過鋼網收集消化液，1 000 r/min離心7 min，棄上清液，DMEM/F12培養液重懸細胞，細胞計數，按2×105/mL接種于培養瓶中，加入含10%FBS的高糖DMEM培養基，37℃、5%CO2培養箱中培養；纖維環組織以0.25%胰酶在37℃下搖床消化30 min，棄上清液。剩余組織加入含有0.25%胰酶、0.25%Ⅰ型膠原酶、0.2%Ⅱ型膠原酶的D-Hanks消化液中，4℃冷消化8 h，次日37℃搖床中消化2 h，鋼網過濾收集消化液，1 000 r/min離心7 min，棄上清液，DMEM/F12培養液重懸細胞，細胞計數，以2×105/mL密度接種于培養瓶中，加入10%FBS高糖DMEM培養基，37℃、5%CO2培養箱內培養。

1.2.3 細胞鑒定 （1）形態學觀察。倒置相差顯微鏡下觀察P2代髓核與纖維環細胞形態。（2）甲苯胺藍染色。P1代髓核與纖維環細胞分別爬片，至80%融合時，4%多聚甲醛固定15 min，1%甲苯胺藍染色10 min，PBS沖洗，二甲苯透明，中性樹脂封片，鏡下觀察細胞分泌糖胺聚糖能力。（3）Ⅱ型膠原免疫組化染色。P1代髓核與纖維環細胞分別爬片，至80%融合時，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%triton X-100打孔20 min，PBS清洗3次；3%H2O2作用15 min，PBS沖洗3次；滴加10%山羊血清封閉液室溫封閉10 min，甩掉后充分晾干；滴加1∶50稀釋的Ⅱ型膠原多克隆抗體，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次；滴加辣根過氧化物酶標記的二抗工作液，室溫孵育2 h，DAB避光顯色15 min；設陰性對照組，沖洗、脫水、封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 對細胞行單軸向循環牽張應力加載 （1）加載周期性牽張力。分別將P3代髓核與纖維環細胞以2×105/mL密度接種于4 cm×2 cm硅橡膠膜上，繼續培養至細胞密度達到約80%，置于BioDynamic力學生物反應艙中進行應力加載。實驗組每組3個樣本，分別以0 με、5萬με、10萬με和15萬με加載，頻率為0.25 Hz加載3 h。實驗所用BioDynamic生物反應艙力學加載裝置以硅橡膠膜片作為細胞微應變加載載體，微應變加載系統由Bose PCI和Win Testing聯合控制參數、持續時間、拉伸、松弛頻率，使彈性膜片產生精準應變，使培養在其膜表面的細胞受到張應力作用。微應變大小以硅橡膠膜載體拉伸應變率（%）表示，應變率越大，表示細胞所受張應力越大。（2）流式細胞術測定細胞周期。細胞加載結束后繼續培養24 h，酶消化法分別收集各組髓核與纖維環細胞，1 000 r/min離心7 min棄上清，用無菌D-Hanks液輕微漂洗2次，75%乙醇固定，0.1%triton X-100處理30 min，10 mg/L碘化丙啶染色，流式細胞儀檢測細胞DNA含量和細胞周期，Flow Plus軟件處理數據。根據細胞周期中G0/G1期和G2/M期細胞比例計算S期細胞比例（%）及細胞增殖指數（prolifera?tive index，PI）。S期（%）=1-[G0/G1期（%）+G2/M期（%）]，PI（%）=S期（%）+G2/M期（%）。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件包處理，符合正態分布的計量數據以均數±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 椎間盤組織病理 鏡下可見纖維環組織細胞成分較少，集群生長，出現血管組織；基質纖維束疏松、紊亂，見圖1。結合病例臨床及病理資料，患者椎間盤為嚴重退變。

Figure 1 Pathological image of annular fibrosus and nucleus pulposus tissue biopsy（HE×100）圖1 纖維環與髓核組織病理切片（HE×100）

2.2 人退變纖維環細胞的培養及鑒定

2.2.1 形態學觀察 原代髓核細胞24 h后開始有少量細胞貼壁，5 d后可達80%融合，多為橢圓、多角形，呈類軟骨樣，胞核大而圓，胞漿豐富，內含分泌顆粒，見圖2，隨著傳代髓核細胞貼壁時間變短，其增殖速度加快。纖維環細胞原代接種后24 h可見大部分細胞貼壁，主要為梭形，呈成纖維樣魚群生長，可見增殖旺盛的生發中心，4 d可達到95%以上融合，見圖3。

Figure 2 Nucleus pulposus cells cultured for 5 d（×100）圖2 髓核細胞原代培養5 d（×100）

Figure 3 Annulus fibrosus cells in primary culture for 4 d（×100）圖3 纖維環細胞原代培養4 d（×100）

2.2.2 甲苯胺藍染色 髓核細胞甲苯胺藍染色顯示胞質均勻藍染，胞核染色強于胞質，細胞分泌糖胺多糖的功能活躍，見圖4；纖維環細胞核呈藍色，基質著色沒有髓核強，髓核細胞更接近于類軟骨細胞特性，見圖5。

Figure 4 Nucleus pulposus cells stained with toluidine blue（×100）圖4 髓核細胞原代甲苯胺藍染色（×100）

Figure 5 Annulus cells stained with toluidine blue（×100）圖5 纖維環細胞原代甲苯胺藍染色（×100）

2.2.3 Ⅱ型膠原免疫組化鑒定 細胞胞質呈褐色，髓核細胞Ⅱ型膠原陽性明顯高于纖維環細胞，見圖6、7。

2.2.4 不同牽張微應變環境對人退變髓核、纖維環細胞增殖的影響 隨著微應變的增加，髓核細胞S期細胞比例在10萬με、15萬με時均高于纖維環細胞，差異有統計學意義（P<0.01），見表1。纖維環細胞PI值在各組微應變環境下均高于髓核細胞，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01），見表2。

Figure 6 Nucleus pulposus cells type II collagen immunohistochemical staining（×100）圖6 髓核細胞Ⅱ型膠原免疫組化（×100）

Figure 7 Annulus fibrosus cells of type II collagen immunohistochemical staining（×100）圖7 纖維環細胞Ⅱ型膠原免疫組化（×100）

Table 1 Effect of cyclic stretch strain on the percentage of cells in S phase of human degenerative nucleus pulposus and annulus fibrosus cells表1 不同循環牽張微應變對人退變髓核與纖維環S期細胞的影響 （n=6,%）

Table 1 Effect of cyclic stretch strain on the percentage of cells in S phase of human degenerative nucleus pulposus and annulus fibrosus cells表1 不同循環牽張微應變對人退變髓核與纖維環S期細胞的影響 （n=6,%）

**P<0.01

組別退變髓核細胞退變纖維環細胞t 0 με 1.90±0.35 1.94±0.37 0.167 5萬με 1.96±0.75 2.33±0.35 1.100 10萬με 7.90±1.33 2.55±0.46 9.339**15萬με 7.94±0.97 2.29±0.71 11.475**

Table 2 Effect of cyclic stretch strain on PI value of human degenerative nucleus pulposus and annulus fibrosus cells表2 不同循環牽張微應變對人退變髓核與纖維環細胞PI值的影響 （n=6,%）

Table 2 Effect of cyclic stretch strain on PI value of human degenerative nucleus pulposus and annulus fibrosus cells表2 不同循環牽張微應變對人退變髓核與纖維環細胞PI值的影響 （n=6,%）

*P<0.05，**P<0.01

組別退變髓核細胞退變纖維環細胞t 0 με 2.90±1.10 16.94±3.44 9.511**5萬με 6.90±1.49 21.13±3.16 9.966**10萬με 14.10±3.03 24.55±3.70 5.341**15萬με 15.04±4.20 22.19±4.46 2.854*

3 討論

椎間盤由髓核、纖維環、軟骨終板3部分組成。在組織學上，椎間盤由細胞及細胞外基質形成，細胞為髓核細胞與纖維環細胞；細胞外基質主要成分為水、膠原和蛋白聚糖。這使得椎間盤具有復雜的生物力學性能，使其能夠最大程度地適應其特殊的力學環境，進而影響著其結構與形態[10-12]。椎間盤退變的主要病理改變為細胞數量減少及細胞外基質的結構、類型及質量的變化。目前認為椎間盤退變過程是一種由生物力學和細胞生物學相互作用引起的復雜病理過程[13]。包含基質的退變和細胞的退變，但其退變過程最初起于細胞功能退變還是基質功能退變，當前研究存在不同認識[14]。

本研究取材首先區分纖維環及髓核組織，并分別送病理以保證組織來源的可靠性。髓核組織分離出的細胞主要為軟骨樣細胞形態，糖胺多糖、蛋白多糖及Ⅱ型膠原染色均為陽性,符合髓核細胞的表達特點。纖維環組織分離獲取的細胞多為纖維樣，部分混雜有軟骨樣細胞但數量較少，甲苯胺藍及Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色均陽性表達。髓核細胞與纖維環細胞在細胞形態學及功能蛋白表達上并無明顯差異，可能與其組織胚胎學來源相同有關。本研究提示髓核與纖維環細胞均可歸為纖維軟骨細胞，這與椎間盤本身的纖維軟骨性質是一致的。隨著微應變的增加，髓核細胞S期細胞百分比在10萬με、15萬με時明顯高于纖維環S期細胞，而纖維環S期細胞則始終處于平穩狀態。S期細胞比例的增加，反映出細胞處于旺盛的有絲分裂狀態，可能原因是相同的微應變刺激下，髓核細胞對刺激更敏感，較小的應變刺激并未影響纖維環細胞的增殖，提示在椎間盤退變過程中髓核細胞可能對應力刺激首先做出反應，這與已有研究的髓核退變早于纖維環退變的結果是一致的[15]。對于細胞周期PI值的觀察中，纖維環細胞PI值在各個微應變環境中均高于髓核細胞PI值，提示在椎間盤退變中，雖然髓核細胞對應力刺激較纖維環細胞敏感，但是對較低的微應變刺激產生的效應，纖維環細胞是始終大于髓核細胞。因此，髓核細胞的退變雖然早于纖維環細胞，但是整個退變過程中纖維環細胞退變速度及程度均大于髓核細胞。另外，應力刺激對于纖維環細胞的調節作用具有雙向性，微應變對纖維環細胞增殖的促進作用有著最適宜應變值，而對于髓核細胞并未出現此最適宜微應變刺激，可能與研究本身設計的微應變加載區間有關。

生物力學因素在椎間盤退變過程中發揮著重要的調節作用，本研究觀察到不同微應變環境對體外培養的髓核與纖維環細胞產生了不同的增殖效應，提示這2種細胞在退變過程中有著不同的退變機制并影響整個椎間盤退變的進展，但微應變環境與其他體內生理生化因素對椎間盤退變的調節機制仍需深入的研究。

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Effect of Stretch Micro-Strain on Proliferation of Human Degenerated Nucleus Pulposus and Annulus Fibrosus Cells

ZHANG Xiaolin,SUN Xiaolei,MA Xinlong

Department of Spine,Tianjin Hospital,Tianjin 300211,China

Objective:To explore the effect of cyclic stretch micro-strain on the proliferation of cultured human degen?erated nucleus pulposus and annulus fibrosus cells.Methods:The human degenerated intervertebral disc came from a case of 29-year-old patient with lumbar disc herniation,and the degree of degeneration was assessed through the pathological di?agnosis.Under the sterile condition，nucleus pulposus and annulus fibrosus cells were cultured respectively using enzymatic digestion.Cell lines were identified.The third generation cells were seeded on the silicone rubber membrane carrier,using the EF3200 mechanical tester equipped with BioDynamic bioreactor system,imposed a frequency of 0.25 Hz,strain 0 με,50 000 με,100 000 με and 150 000 με loaded 3 h,and then the proliferation activity was detected in different strain environ?ment using flow cytometry.Results:The degenerated nucleus pulposus and annulus fibrosus cells grew well after the stress load.With the micro-strain increased,the percentage of degenerative nucleus pulposus cells in S phase was significantly high?er than that of annulus fibrosus cells in 100 000 με and 150 000 με (P<0.01).The PI value of degenerative annulus fibrosus cells was significantly higher than that of nucleus pulposus cells in every micro-strain value(P<0.05).Conclusion:The overall effect of micro-strain loading on human degenerated nucleus pulposus and annulus fibrosus cells is consistent.The promotion effect on proliferation is significantly higher in annulus fibrosus cells than that of nucleus pulposus cells under the same micro-strain stimulation.

intervertebral disk displacement flow cytometry intervertebral discs degeneration nucleus pulposus cells annulus fibrosus cells stretch micro-strain proliferation index

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.008

*天津市衛生局科技基金項目（項目編號：2011KZ57）

300211天津市天津醫院脊柱外科（張曉林），骨科研究所（孫曉雷），骨科（馬信龍）

△通訊作者E-mail:maxinlong8686@sina.com

（2012-03-06收稿 2012-07-06修回）

（本文編輯 李國琪）