抑癌基因WWOX和p53在結直腸癌中的表達及臨床意義

張繼平

抑癌基因WWOX和p53在結直腸癌中的表達及臨床意義

張繼平

目的：探討WWOX和p53基因在結直腸癌組織中的表達情況、與臨床病理參數的關系及兩者表達的相關性。方法：采用免疫組織化學染色法(SP法)檢測對照組正常結直腸組織25例、結直腸癌組織45例中WWOX和P53蛋白的表達情況，分析兩者的表達與患者年齡、性別及癌組織的病理參數包括腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移的關系，以及兩者表達的相關性。結果：WWOX蛋白在癌組織中陽性表達明顯降低，與正常組織比較差異有統計學意義（P<0.05)，P53(突變型)蛋白在癌組織中較正常結直腸組織中陽性表達率高，差異有統計學意義（P<0.05）。無論WWOX，還是P53蛋白的陽性表達率，在不同癌組織學分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移情況、生存期分類的患者結直腸癌組織差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），而在不同性別、年齡、腫瘤大小分類患者差異無統計學意義（P<0.05）；WWOX與p53基因的表達呈負相關（r=-0.388，P=0.008）。結論：WWOX和p53（野生型）同為抑癌基因，檢測兩者的表達對于結直腸癌的臨床診斷及預后判斷有重要意義。

結直腸腫瘤 癌 基因,p53 免疫組織化學 病理學,臨床 WWOX

結直腸癌的發病率居我國消化道惡性腫瘤前列，且有逐年增高的趨勢[1]。結直腸癌的病因尚未完全清楚，其發生涉及由眾多環境因素、遺傳因素構成的多階段、多因素復雜的病因鏈，涉及多種癌基因的激活、抑癌基因的失活以及由此引起的細胞生物學行為的改變等。各種基因通過相互作用，共同參與腫瘤的發生發展。本研究通過檢測結直腸癌中WWOX、p53的表達情況，探討其與結直腸癌發生發展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2005年3月—2010年12月通過手術及內鏡活檢結腸癌組織及癌旁黏膜標本共70例。依據病理檢查結果分為2組：結直腸癌組45例，所有患者術前（或組織活檢前）均未接受放療或化療；正常對照組25例，正常黏膜組織取自腫瘤切緣≥5 cm處，經病理學檢查取材干凈，無癌細胞浸潤。結直腸癌組男33例，女12例，年齡32~83歲，平均年齡（67±2）歲，＞ 60歲者30例，≤60歲者15例；腫瘤直徑<4 cm者28例，＞4 cm者17例；分化程度為高分化6例，中分化19例，低分化腺癌20例；浸潤深度為T1期2例，T2期14例，T3期6例，T4期23例，因T1、T3期較少，將T1、T2合并為T1+T2(侵及黏膜、黏膜下或肌層)共16例，T3、T4合并為T3+T4(侵及漿膜層和侵出漿膜層)共29例；有淋巴結轉移者24例，無淋巴結轉移者21例。生存期監測中為了排除組織學類型及治療方法不同對預后的影響，選取其中同一組織學類型及相同治療方法并有完整臨床隨訪資料的病例，生存期的計算是從手術日期起到隨訪日期或由于復發、轉移而死亡的日期，隨訪主要采用電話、門診獲得，失訪者和非癌死亡者未納入本組病例，本組5年生存率57.7%。

1.2 主要試劑與儀器 主要免疫組化試劑：兔抗人P53單克隆抗體購至北京中杉金橋生物技術有限公司，兔抗人WWOX多克隆抗體、通用型二步法免疫檢測試劑盒PV-6000（抗兔）、DAB顯色盒購自美國Invitrogen公司，即用型SABC免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。主要儀器設備包括包埋機、病理切片機、恒溫水浴箱、顯微鏡及照相裝置等。

1.3 方法

1.3.1 WWOX與P53免疫組織化學染色 標本常規固定、包埋、切片等，采用免疫組織化學SP法按試劑盒使用說明書進行檢測，WWOX兔抗人多克隆抗體稀釋濃度為1∶300。用免疫組化方法檢測的P53蛋白是突變型，P53鼠抗人單克隆抗體稀釋濃度為1∶100。染色步驟嚴格按照說明書進行，以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 免疫組化結果判斷 （1）WWOX蛋白染色以腺體細胞漿內出現黃色顆粒為陽性，按照Hao等[2]推薦的方法觀察WWOX在結直腸癌中的表達情況及分布，陽性強度、缺失強度和陽性率。先按染色強度打分，0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，染色強度需與染色背景相對比，再按陽性細胞百分比打分，0分為0~5%，1分為6%~25%，2分為26%~50%，3分為51%~75%，4分為75%以上。以上述兩項之積，0~4分為蛋白表達缺失或降低(陰性)，5~12分為中、高度陽性表達(陽性)。（2）P53蛋白陽性信號定位于細胞核，為黃至棕褐色顆粒，且其著色強度高于背景非特異性染色者判定為陽性。判斷結果參照1996年全國免疫組織化學技術與診斷標準化專題研討會意見[3]，以連續觀察10個高倍視野(×400)，免疫反應陽性細胞數超過25%作為組織陽性診斷標準。標準定級為：無陽性著色細胞為陰性(-)，陽性著色細胞<25%為弱陽性(+)，陽性著色細胞25%~50%為陽性(++)，陽性著色細胞>50%為強陽性(+++)。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件包進行處理，計數資料的比較采用χ2檢驗；WWOX和P53蛋白表達的相關性分析用Spearman等級相關；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果 （1）WWOX蛋白陽性染色主要位于細胞胞漿中，呈深黃色彌漫性分布，間質細胞亦可見散在部分表達。WWOX蛋白陽性在正常結直腸黏膜腺體細胞中染色較強，在癌組織中黏膜腺體細胞染色較弱。WWOX蛋白在正常對照組和結直腸癌組中的陽性表達率分別為76.00%（19/25）和33.33%（15/45），差異有統計學意義（χ2=11.71，P<0.01）。（2）P53蛋白主要分布在胞核，細胞胞漿中也有少量表達，呈棕黃色顆粒者為陽性。P53蛋白在正常結直腸黏膜中低表達，在結直腸癌中染色較強。P53蛋白在正常對照組和結直腸癌組中的陽性表達率分別為16.00%（4/25）和68.88%（31/45），差異有統計學意義（χ2=17.98，P<0.01）。

2.2 WWOX和P53蛋白表達與臨床病理特征的關系 不同組織分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、生存期分類結直腸癌患者WWOX和P53陽性表達差異有統計學意義（均P<0.05）；不同年齡、性別、腫瘤直徑分類患者WWOX和P53陽性表達差異無統計學意義（均P>0.05），見表1。

Table 1 Comparison of positive expression of WWOX and P53 between different clinical pathological characteristic groups of colorectal cancer表1 不同臨床病理特征結直腸癌組織WWOX、P53陽性表達情況比較 （例）

2.3 結直腸癌組織中WWOX和P53蛋白表達的相關性 結直腸癌組織中WWOX和P53表達呈負相關（rs=-0.388，P ＜ 0.05），見表2。

Table 2 Correlation of positive expression of WWOX and P53 in colorectal cancer表2 WWOX和P53在結直腸癌中陽性表達的相關性

3 討論

癌基因的激活和抑癌基因的失活是近年來腫瘤研究中的熱點，其中抑癌基因的失活是重要的致癌因素。WWOX基因是一種候選抑癌基因，定位于人類染色16q23.3-24.1，跨越了整個常見染色體脆性位點FRA16D，編碼的蛋白質包含氨基端的2個WW結構域和羧基末端的1個短鏈脫氧/還原酶結構域(SDR)。WWOX編碼的蛋白質在腫瘤壞死因子(TNF)誘導的凋亡中是一個非常重要的中介，并與P53共同調節細胞的凋亡。研究證實，WWOX在胃癌、食管癌、胰腺癌等癌組織中存在著表達缺失或低表達[4-5]。

人類p53基因是一個非常重要的抑癌基因。p53基因具有進化保守性，是細胞生長重要的負調節因子。當p53基因發生突變時，可喪失正常活性，抑制細胞凋亡，并且促進細胞惡性轉化，侵襲力增強，使p53基因由抑癌基因轉為原癌基因。正常細胞中P53蛋白是無突變的野生型P53蛋白，具有腫瘤生長抑制功能，因其半衰期較短，不易被檢測，用免疫組化方法檢測的是突變型P53蛋白。目前發現肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、結腸癌等多種惡性腫瘤的發生、發展均與p53基因突變有關[6-7]。

WWOX蛋白與P53蛋白同為促凋亡蛋白，在介導凋亡中發揮協同作用。WWOX基因是P53介導凋亡必不可少的配偶體。在應激凋亡中，活化的WWOX蛋白、P53、JNKl常形成異源三聚體而共同發揮作用。WWOX基因在多種消化道腫瘤如食管癌、胃癌、結直腸癌等組織中表達降低或缺失，而p53基因(突變型)的表達則明顯增高，兩者的表達呈負相關[8]。WWOX發揮其正常的生物學行為、抑制腫瘤過程中均與p53有關，p53對大腸癌發生轉移過程中WWOX起著調控和（或）協同作用。本研究結果顯示WWOX與p53（突變型）基因的表達呈負相關，提示正常p53（野生型）基因的突變與WWOX基因的表達降低或失活在大腸癌的發生、浸潤和轉移中起著協同作用。

本研究結果表明，WWOX基因在結直腸癌組織中陽性表達率明顯低于癌旁正常組織，突變型p53基因在結直腸癌組織中陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，差異均有統計學意義，提示WWOX和p53（野生型）基因同作為抑癌基因，起到抑制腫瘤生長的作用，其可能作為一種新型腫瘤標志，有助于結直腸癌的診斷。與其他研究結果[8]相似，組織分化程度越差、浸潤越深、伴有淋巴結轉移、生存期短者WWOX蛋白表達就越低，突變型P53蛋白表達率越高，反之亦然，提示WWOX和P53表達情況可能有助于判斷腫瘤的惡性程度、進展及術后生存情況。WWOX和P53蛋白（突變型）表達呈負相關，提示腫瘤的發生、發展涉及多基因的改變，WWOX表達降低或缺失與p53基因的突變在結直腸癌的發生、浸潤和轉移過程中可能起著協同或調控作用，兩者可能存在某種未知的通路。

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[3]中華病理學雜志編輯委員會.全國免疫組織化學技術與診斷標準化專題研討會會議紀要[J].中華病理學雜志,1996,25（6）:326-328.

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Expression and Clinical Significance of WWOX and p53 Genes in Colorectal Carcinoma Tissues

ZHANG Jiping

General Hospital of China National Offshore Oil Corporation,Tianjin 300452,China

Objective:To investigate expressions of WWOX and p53 genes in colorectal cancer，and to discuss the cor?relation between WWOX,p53 expressions and clinical pathological parameters．Methods:The expressions of WWOX and p53 were detected by immunohistochemical staining methods in 45 samples of colorectal cancer and 25 samples of normal tis?sues.The relationship between levels of these proteins with age,gender,tumor size，infiltration depth and lymph nodes metas?tasis were analyzed.Results:The positive rate of WWOX proteins was significantly lower in colorectal cancer than that in normal tissue group(P<0.05).While there was a significantly higher positive rate of P53（mutant type）protein in colorectal cancer than that in normal tissue group(P<0.05).The positive rates of WWOX and P53 expression were closely correlated with histological grade，infiltration depth，lymph node metastasis and 5-year survival(P<0.05)．There was no significant dif?ference between age,gender and carcinoma size(P>0.05).The expression of WWOX and p53 genes demonstrated signifi?cantly negative relation(r=-0.388，P=0.008).Conclusion:WWOX and p53(wild type)genes are all tumor suppressor genes.The joint investigation of expression has more important significance in clinical diagnosis and prognosis judgment．

colorectal neoplasms carcinoma genes,p53 immunohistochemistry pathology,clinicalWWOX

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.011

300452 海洋石油總醫院消化內科

（2011-07-19收稿 2012-02-07修回）

（本文編輯 李國琪）

短篇與病例報告