碘標錳卟啉及其小鼠體內分布

刁 堯，劉新寧，官文征，趙文瑾，劉 潔，趙 恂，于成國

1.中國醫科大學 實驗技術中心，遼寧 沈陽 110001；2.阜新市第二人民醫院，遼寧 阜新 123000；3.中國醫科大學 第94期臨床醫學七年制英文班，遼寧 沈陽 110001

錳5,10,15,20-(4-苯甲酸)卟啉[ Mn(Ⅲ)tetrakis(4-benzoic acid)porphyrin chloride(MnTBAP)]，分子式 C48H28ClMnN4O8，相對分子質量879.2，分子結構式示于圖1。常溫下MnTBAP為黑色晶體。MnTBAP是以卟啉環為配體的大環類SOD模擬物和廣譜的游離基清除劑，它同時具有SOD和過氧化氫酶(catalase,CAT)的特性[1]。文獻報道MnTBAP具有抗炎、抗氧化、抗自由基損傷、保護肝臟、神經損傷等作用[2-6]。雖然MnTBAP的藥效涉及很多方面，但其在生物體內的具體代謝和分布行為的報道較少，這妨礙了對MnTBAP相關藥效的更深入研究。本研究擬采用靈敏的放射性示蹤法分析MnTBAP在小鼠體內的分布特點，以揭示其主要的代謝方式。

圖1 MnTBAP的分子結構式

1 實驗部分

1.1 主要材料

MnTBAP，Calbiochem公司，純度大于95%；Na131I，中國原子能科學研究院；Iodogen，Sigma公司；KM小鼠(SYXK(遼)2008-0005)，中國醫科大學實驗動物中心；FJ-2008PS型γ計數儀，西安核儀器廠；PMI 170-9400磷屏成像儀，美國Bio-Rad公司；聚酰胺薄膜，國藥集團化學試劑有限公司；其它試劑為國產分析純。

1.2 131I-MnTBAP的制備

采用Iodogen法對MnTBAP進行131I標記。標記管中預先涂以 Iodogen 50 μg，向標記管中依次加入50 μL MnTBAP樣品(1 g/L，二甲基亞砜(DMSO)溶解)、10 μL 18.5 MBq Na131I，振蕩反應10 min，以生理鹽水溶解，放置備用。以聚酰胺薄膜為支持介質，生理鹽水為展開劑，測定其標記率和放化純度。

1.3 131I-MnTBAP標記化合物放化純度的鑒定

采用薄層層析法，吸取碘化反應液2 μL，在距聚酰胺薄膜薄層層析板底端1 cm處點樣，游離131I-作為對照點樣，點樣直徑0.2 cm，冷風吹干。生理鹽水為展開劑，上行展開，131I-MnTBAP的Rf=0～0.1，游離的131I-的Rf=0.9。展開結束后晾干，磷屏成像儀成像，然后分段剪取聚酰胺層析板，經γ放免計數儀測量放射性計數，計算標記率、放化純度和放射性比活度。標記物的標記率(%)=(131I-MnTBAP的放射性計數/點樣量總放射性計數)×100；比活度(Bq/μg)=(放射性核素投入量×標記率)/投入的MnTBAP總量。

1.4 131I-MnTBAP標記化合物的純化

采用薄層層析法，聚酰胺薄膜薄層層析板，6 cm×20 cm，距底邊1.5 cm處鉛筆畫線設為原點，點樣直徑為0.2 cm，冷風吹干。生理鹽水為展開劑，上行展開。晾干，磷屏成像儀成像，根據已知的Rf值，在原點處刮下聚酰胺粉末(吸附有131I-MnTBAP)置于清潔玻璃小瓶中，DMSO溶解，反復多次，真空泵吹干標記物附著于管壁，DMSO助溶，取2 μL進行薄層層析，進行放射化學純度鑒定。

1.5 131I-MnTBAP 標記化合物的體外穩定性實驗

取50 μL純化后的標記物分別加入到100 μL以下2種體系中：生理鹽水、新鮮人血清。在37 ℃下貯存，分別于2、24、48 h取樣，聚酰胺薄膜層析測定放化純度，觀察標記物的穩定性。

1.6 131I-MnTBAP的小鼠體內分布

42只KM小鼠(約20 g，4周齡)隨機分為7組(n=6)，各組每只鼠經尾靜脈注射200 μL131I-MnTBAP(每只約185 kBq)，各組小鼠分別于注射后5、10、30、60、120、240、1 440 min斷頭處死，取心、肝、脾、肺、腎、肌肉、骨骼、胃、腸、生殖腺、腦、脊髓、甲狀腺、頜下腺、血，稱重，測各個樣品放射性計數，計算每克組織放射性攝取占注入量的百分率(%ID/g)。

1.7 統計方法

實驗數據以x±s表示，結果采用t檢驗。

2 結果

2.1 131I-MnTBAP的標記率及穩定性

在以聚酰胺薄膜為支持介質、生理鹽水為展開劑的體系中，131I-MnTBAP的Rf=0～0.1，游離的Na131I的Rf=0.9。經測定，131I-MnTBAP的標記率達96.3%，放射性濃度為57.45 GBq/L，比活度為0.36 TBq/g。

2.2 131I-MnTBAP的體外穩定性

131I-MnTBAP在不同體系中、37 ℃下的穩定性結果示于圖2。由圖2可以看出，標記物在人血清和生理鹽水2種體系中，37 ℃下放置48 h，標記物的放化純度仍大于90%，表明標記物在37 ℃下體外穩定性較好。由131I的標記位點分析，131I可能標記在Mn(Ⅲ)上，即取代Cl或配位于Cl的對位。131I-MnTBAP薄層層析放射性分布圖示于圖3。

圖2 131I-MnTBAP的體外穩定性

圖3 131I-MnTBAP薄層層析示意圖

2.3 131I-MnTBAP小鼠體內分布

動物實驗結果列于表1。表1結果表明，靜脈注射給藥后131I-MnTBAP在體內分布廣泛。血中清除較快，注射后5 min時即達峰值，其放射性攝取為5.55%ID/g；肝、腎和肺中分布較高，注射后5 min時其放射性攝取分別為8.34%ID/g、12.23%ID/g、6.75%ID/g，而后緩慢下降，注射后4 h時分別為0.34%ID/g、0.73%ID/g、0.13%ID/g，表明131I-MnTBAP在體內主要經肝、腎代謝；131I-MnTBAP在腦和脊髓中分布較少，注射后5 min時其放射性攝取均為0.11%ID/g；甲狀腺內的放射性隨時間的延長而逐漸增加，甲狀腺與血液的放射性攝取比值由靜脈注射131I-MnTBAP后5 min時的1.5倍升至240 min時的14倍，與時間基本呈線性關系。

3 討 論

MnTBAP藥理作用廣泛，主要有抗炎、抗氧化、抗自由基損傷、保護肝臟、肺臟及腦、脊髓組織氧化損傷等作用[7-9]。它是一種新興的、穩定的相對分子質量較小的新型非肽類SOD模擬分子，克服了傳統SOD的缺陷，具有以下的優點：(1)它同時具有SOD和過氧化氫酶(catalase,CAT)的特性；(2)相對分子質量小，具有細胞滲透性，易于透過細胞膜進入細胞內部(如線粒體或微粒體等部位)；(3)不具有免疫原性而不會引起機體的免疫反應；(4)體內穩定，不發生分解代謝并可隨著尿液排出,無明顯毒副作用[10-12]。

本實驗制備的131I-MnTBAP標記物體外穩定性實驗結果顯示，標記后48 h的放化純度維持在90%以上(溶于新鮮人血清中)，適于MnTBAP在體內外的微量示蹤研究，為下一步研究提供了可靠保障。利用131I-MnTBAP具有靈敏準確的放射性示蹤特點，可用于觀察分析其在整體生物體內的代謝過程和可能的作用靶點。

分布實驗的結果顯示，靜脈注射給藥后131I-MnTBAP在體內廣泛分布，主要分布于肝、肺、腎，其中，以腎臟分布最多，肝、肺次之，說明肝、肺臟對MnTBAP具有很高的攝取率，腎臟是其主要的代謝臟器，此結果提示131I-MnTBAP可為MnTBAP保護肝、肺臟的研究提供一個靈敏的分析方法。MnTBAP在腦、脊髓中分布較少，揭示其難于透過血腦屏障(BBB)，與文獻報道一致[13]。

表1 131I-MnTBAP在小鼠體內的生物分布

注(Note):n=6

131I-MnTBAP在甲狀腺內的放射性隨時間的延長而逐漸增加，反映出其在體內有一個漸進性的脫碘過程；同時體外穩定性實驗結果也顯示其在生理鹽水中不夠穩定，從分子結構分析，其分子結構存在的苯甲酸基及卟啉環結構使得整個分子極性較大而脂溶性較少，這是分子難于透過BBB的重要原因之一，也是其在生理鹽水中不穩定的原因之一，因此，在體內生理條件下可能易脫碘而不穩定，所以本實驗采用DMSO溶解效果較生理鹽水好。

碘標的MnTBAP能靈敏地反映其在小鼠體內的基本代謝過程，可進一步結合其它分子生物學技術分析其在體內精確的代謝行為及可能的作用機制。

致謝：感謝中國醫科大學實驗技術中心崔澤實教授在磷屏成像儀應用上給予的支持和幫助。

[1]Day B J,Fridovich I,Crapo J D.Manganic Porphyrins Possess Catalase Activity and Protect Endothelial Cells Against Hydrogen Peroxide-Mediated Injury[J].Arch Biochem Biophys,1997,347(2):256-262.

[2]Salvatore C,Basilia Z,Giuseppina,et al.Beneficial Effects of Mn(Ⅲ)TETRAKIS(4-Benzoic Acid)P Orphyrin(Mn-TBAP):a Superoxide Dismutase Mimetic in Carrageenan-Induced Pleurisy[J].Free Radical Biol Med,1999,26(1/2):25-33.

[3]Joseph S T,Eric B,Natasha O’R,et al.An Alternative Ca2+-Dependent Mechanism of Neuroprotection by the Metalloporphyrin Class of Superoxide Dismutase Mimetics[J].The FASEB,2005,4:1-16.

[4]Day B J,Batinic-Haberle I,Crapo J P.Metalloporphyrins Are Potent Inhibitions of Lipid Peroxidation[J].Free Radic Biol Med,1999,26:730-736.

[5]Patel M,Day B J.Metalloporphyrin Class of Therapeutic Catalytic Antioxidants[J].Trends Pharmacol Sci,1999,20:359-364.

[6]Pearlstein R D,Higuchi Y,Moldovan M,et al.Metalloporphyrin Antioxidants Ameliorate Normal Tissue Radiation Damage in Rat Brain[J].Int J Radiat Biol,2010,86(2):145-163.

[7]Qian J M,Zhang H,Xiao F,et a1.Improvement of Recipient Survival After Small Size Graft Liver Transplantation in Rats With Pre-Ischemic Manipulation or Administering Antisense Against Nuclear Factor-KB[J].Trans Plant International,2007,20:784-789.

[8]Tulliez M,Bedda S,Trebeden H,et a1.The Superoxide Dismutase Mime Tic Mn-TBAP Prevents Fas-Induced Acute Liver Failure in the Mouse[J].Gastroenterology,2001,121:1 451-1 459.

[9]Salvemini D,Wang Z Q,Zweier J L,et a1.A Nonpeptidyl Mimic of su Peroxide Disnutase With Therapeutic Activity in Rats[J].Science,1999,286:304-306.

[10] Madsen-Bouterse S A,Zhong Q,Mohammad G,et al.Oxidative Damage of Mitochondrial DNA in Diabetes and Its Protection by Manganese Superoxide Dismutase[J].Free Radic Res,2010,44(3):313-321.

[11] Lu X M,Zhang G X,Yu Y Q,et al.The Opposite Roles of nNOS in Cardiac Ischemia-Reperfusion-Induced Injury and in Ischemia Preconditioning-Induced Cardioprotection in Mice[J].J Physiol Sci,2009,59(4):253-262.

[13] Ling X,Liu D.Temporal and Spatial Profiles of Cell Loss After Spinal Cord Injury:Reduction by a Metalloporphyrin[J].J Neurosci Res,2007,85(10):2 175-2 185.