聚氧乙烯辛烷基酚制備去細胞神經移植體

張增祥 趙寶輝 任 寶 薛金偉 張 旋 (河北大學附屬醫院骨科，河北 保定 07000)

周圍神經損傷后造成的較長節段缺損的修復一直是臨床治療中的難題。自體神經移植被公認為是周圍神經缺損修復的“金標準”，但對長距離缺損或神經叢的損傷，往往因沒有充足的自體神經來源而使治療陷于困境，且切取后有供區麻木、疤痕、神經瘤等并發癥。同種異體神經來源充足，可以方便地選擇與受損神經結構相同或相似的神經修復受損神經，但免疫排斥反應限制了異體神經的臨床應用。用組織工程方法降低神經的免疫原性，構建組織工程化神經移植體，就可能應用同種異體神經修復周圍神經缺損，將為臨床修復周圍神經缺損開辟一條新的治療途徑。本研究用聚氧乙烯辛烷基酚(Triton X-100)萃取周圍神經以去除雪旺細胞等抗原成分，為制備具有天然神經結構的人類去細胞組織工程化神經移植體提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 動物：健康新西蘭大耳白兔30只(兔齡2～3個月)，由河北醫科大學實驗動物中心提供。材料：Triton X-100(Sigma公司)，HITACHIH IB-3型真空離子鍍膜儀、HITACHIH S-3500N型掃描電鏡由河北醫科大學電鏡實驗中心提供、層黏連蛋白(Laminin)免疫組化染色試劑等由北京中山生物技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗標本和取材 用空氣栓塞法處死白兔后固定于俯臥位，分別自梨狀肌下緣水平以遠切取10 mm雙側坐骨神經60根。隨機分為6組，其中A(12 h組)、B(24 h組)、C(48 h組)、D(96 h組)、E(1 w組)用于化學萃取，F(新鮮神經)為對照組。

1.2.2 化學萃取 先在手術顯微鏡下剪去表面的脂肪組織和部分神經外膜，然后置于4℃蒸餾水中靜置6 h，使細胞和髓鞘在低滲液體中膨脹、細胞被脹破，使之易于Triton X-100的滲透;再將神經放入3%Triton X-100水溶液中分別靜置12 h;置于蒸餾水中振蕩、漂洗6 h，以使溶于水的Triton X-100膜蛋白復合體充分脫離神經干。如此反復，并且每次更換蒸餾水、Triton X-100水溶液。5組神經Triton X-100萃取時間分別為12 h、24 h、48 h、96 h、1 w。

1.2.3 標本處理 在新鮮神經和萃取后的神經中段分別切取2段2 mm神經，1段神經10%甲醛固定，常規石蠟包埋、縱形切片，分別行HE染色，鏡下觀察雪旺細胞及神經結構;磷鎢酸蘇木素(PTAH)染色;光鏡下觀察髓鞘;阿爾辛藍(Alcian blue)染色;光鏡下觀察髓鞘和基底膜;Laminin免疫組化染色;光鏡下觀察基底膜及其主要成分Laminin。對Laminin免疫組化染色切片進行圖像采集，并用真彩色病理圖像分析系統對采集的圖像作定量分析，對Laminin抗體陽性部位進行灰度測量，計算單位面積平均灰度。另1段神經2.5%戊二醛固定。

1.3 統計學分析 運用SPSS10.0軟件行單因素方差分析。

2 結果

2.1 一般性狀觀察 新鮮神經光澤度好，質地較硬，有彈性;神經萃取過程中可見兩端及周圍有絮狀物析出，萃取后神經呈淡乳白色，色暗，無光澤，其外徑及長度較新鮮神經減小，柔軟，有韌性，適宜顯微操作。

2.2 石蠟切片組織學觀察

2.2.1 HE染色 新鮮神經均可觀察到雪旺細胞及軸突等結構，雪旺細胞分布均勻，細胞核深染，神經內膜呈管柱狀排列整齊，髓鞘清晰可見(圖1A)。神經上的雪旺細胞隨著處理時間的延長而逐漸減少，分布不規則。細胞核著色變淺，神經內膜與髓鞘的界限不清。萃取96 h時，神經纖維結構消失，紅染的神經內膜呈波浪狀縱形排列，形成管柱狀空隙(圖1B)。

2.2.2 PTAH染色 鏡下可觀察到染成藍色的神經纖維和基底膜，棕紅色的管柱狀髓鞘結構，膠原纖維染成淺紅或不著色。新鮮神經可觀察到藍色顆粒狀的神經軸突，棕紅色髓鞘位于軸突周圍，排列規則(圖1C)。萃取時間為96 h時，去細胞神經顯示神經纖維及髓鞘完全消失，僅留下波浪狀的基底膜(圖1D)。至1 w時仍可見藍染的基底膜，但連續性欠佳。

圖1 石蠟切片組織學觀察結果(×400)

2.2.3 Alcian blue染色 髓鞘粉染，神經基底膜呈綠色。新鮮神經可見粉染的髓鞘、綠色的基底膜排列整齊，基底膜位于髓鞘的外面(圖1E)。隨著萃取時間的延長，雪旺細胞、粉染髓鞘逐漸減少，髓鞘與基底膜的界限不清，至96 h時去細胞神經縱切片上髓鞘消失，綠色的基底膜呈柵欄樣排列，膜與膜之間為中空結構的基底膜管(圖1F)。萃取時間為1 w時基底膜排列規則，鏡下所見與96 h時相仿，基底膜仍清晰完整，但管狀結構排列不規則，部分斷裂。

2.2.4 Laminin免疫組化染色 基底膜染成棕紅色，細胞核淡藍染。新鮮神經縱切片上，棕黃染色的神經基底膜呈帶狀縱形排列，位于軸突周圍，排列成管狀，并可見藍染的細胞核(圖1G);隨著萃取時間的延長，神經上細胞結構、軸突逐漸減少，96 h的標本觀察，去細胞神經上細胞結構、軸突已消失，染成棕黃色的基底膜則被保留，呈管狀縱形排列，膜與膜之間空虛(圖1H)。至1 w時棕紅色基底膜仍清晰，管狀結構欠規則。

2.3 計算機圖像分析 對Laminin免疫組化染色的切片進行圖像采集，A～F組切片單位面積Laminin平均灰度分別為140.1±3.41;142.1±3.14;142.1±3.14;140.4±4.03;141.7±2.62;142.7±7.24，各組間比較無顯著差異(P=0.751)。

3 討論

神經的再生主要取決于神經細胞所處的微環境，其主要因素是雪旺細胞和細胞外基質所含的基底膜;基底膜可以反作用于雪旺細胞，增強雪旺細胞遷移和 büngner's帶的形成〔2〕;刺激雪旺細胞分裂增殖，沒有基底膜，雪旺細胞雖可分裂增殖，但卻無法分化成髓鞘，二者關系密切，共同作用，為神經再生提供適宜的微環境。實驗表明基底膜各成分對雪旺細胞的貼壁黏附、分裂增殖以及雪旺細胞的髓鞘化有重要的作用，所有雪旺細胞均由一層基底膜包裹，這層基底膜形成一個跨越郎飛氏結的連續管狀覆蓋。

同種異體神經移植的主要問題是免疫排斥反應，而移植免疫的核心問題是組織相容性復合體(MHC-Ⅱ)。周圍神經MHC-Ⅱ的表達產物主要存在于雪旺細胞膜表面，構成了雪旺細胞的膜抗原，其抗原性最強，是產生移植免疫的主要原因〔3〕。如何成功去除細胞和髓鞘結構，以減輕移植體的免疫原性，成為構建組織工程化神經移植體基本問題;能否成功保留雪旺細胞基底膜及其立體管狀結構，并保留其主要成分層黏連蛋白的活性，以發揮其促進神經再生、促進雪旺細胞的黏附、遷移、增殖、分化以及基因表達的調控重要的作用，是用組織工程學方法制備神經移植體的核心問題。

Sondell等〔4〕曾報道用Triton X-100和脫氧膽酸處理鼠的坐骨神經，剩余的主要成分為無損傷的基底膜管，從而達到化學萃取的目的。經過化學萃取處理的異體神經移植體無明顯抗原性，去細胞神經能夠促進和誘導宿主雪旺細胞向移植段內滲透、遷移和增殖〔5〕，有效地促進受體的軸突再生，且無明顯排異反應。

Triton X-100是一種溫和的非離子型表面活性劑，具有兩親結構，Triton X-100中的疏水端能和膜蛋白的疏水區結合形成復合物，溶解于溶液中〔6〕，本實驗采用3%Triton X-100，因為濃度為0.03～5%的水溶液的濁點基本接近，由此可判斷其親水性或疏水性相近似。神經在低滲液體中浸泡處理后，神經雪旺細胞、髓鞘及其他細胞結構被脹破，以利于Triton X-100的浸潤，Triton X-100能徹底破壞生物膜，并且清除磷脂類物質，從而使細胞溶解破壞。而細胞外基質具有不溶性，所以可完整保留。這一點在實驗中得到充分體現，萃取過程中可發現在神經兩端及周圍有絮狀物析出，隨著萃取時間的延長，析出絮狀物逐漸減少。萃取后神經外徑及長度較新鮮神經減小，柔軟，有韌性，適宜顯微操作。雪旺細胞、軸突、髓鞘被成功去除，保留了雪旺細胞基底膜。并且各組神經層黏連蛋白仍具有其原有活性。用此法制備的神經移植體是一種天然立體管狀支架，保存了完整的雪旺細胞基膜管結構。基膜管的主要成分是層黏連蛋白、纖維黏連蛋白、Ⅳ型膠原等細胞外基質，具有促進引導神經再生的作用。此種支架對雪旺細胞的黏附及其成熟和功能表達又有促進作用。

本實驗成功地建立了制備周圍神經移植體組織工程學方法。該支架有良好的仿生性，既可直接移植修復周圍神經缺損，又可作為雪旺細胞植入的支架，應用前景廣闊。但移植體與受體的生物相容性如何，促進神經再生的效果如何，怎樣保存與保存時限如何確定，能否在移植體內植入雪旺細胞等，仍需進一步的實驗論證。

1 Fawcett JW，Keynes RJ.Muscle basal lamin：a new graft material for peripheral nerve repair〔J〕.J Neurosurg，1986;65(3)：354-63.

2 Milner R，Wilky M，Nishimura S，et al.Division of labor of cells in engrains during migration on peripheral nerve extracellular matrix ligands〔J〕.Dev Biol，1997;185(2)：215.

3 Trumble TE，Shon FG.The physiology of nerve transplantation〔J〕.Hand Clin，2001;16(1)：105-22.

4 Sondell M，Lundborg G，Kanjie M.Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction〔J〕.Brain Research，1998;795(1)：44-54.

5 Dument CE，Hentz VR.Enhancement of axon growth by detergent extracted nerve grafts〔J〕.Transplantation，1997;63(9)：1210-5.

6 鐘靜芬.表面活性劑在藥學中的應用〔M〕.北京：人民衛生出版社，1996：13-37.