胎鼠間充質干細胞對老年小鼠心血管系統衰老的影響

祝愛珍 劉成成 陳小宇 李 軍 何冬梅 劉革修 (暨南大學醫學院血液病研究所，廣東 廣州 510632)

關于細胞衰老的原因有多種學說，包括基因組和線粒體基因組完整性的喪失、基因表達失衡、遺傳因素、DNA損傷、氧化損傷、端粒末端的縮短等〔1〕。細胞的衰老是不可抗拒的，但是可調控的〔2〕。間充質干細胞(MSCs)作為多能干細胞，不僅具有極強的分化能力，而且具有產生多種生物活性因子、調節組織特異細胞活性的作用。在體外常用來做飼養層細胞擴增胚胎干細胞、造血干細胞等，在體內起著穩定組織內環境的作用。隨年齡的增長機體MSCs的質量和含量不斷下降，對組織特異細胞的支持調節作用下降，導致組織特異細胞衰老的加速。用更原始的細胞不斷補充替代衰老的細胞或者發揮其相應功能是否能起到抗衰老作用?本實驗設想通過不斷輸注外源性MSCs改善心血管系統衰老進程，為臨床心血管抗衰老研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 天津市灝洋生物制品科技有限責任公司的小鼠SRY DNA生物素標記POD和熒光FISH原位雜交雙染色系統(Y染色體原位雜交試劑盒)，美國GIBCO公司的DMEMF12液體培養基，奧地利PAA公司胎牛血清，加拿大Visual Sonics公司Vevo770?高分辨率小動物超聲系統，地塞米松、胰島素、吲哚美辛、異丁基甲基黃嘌呤、抗壞血酸、β-磷酸甘油、茜素紅購自Sigma。

1.2 實驗動物 四川省人民醫院實驗動物研究所SPF級雌性BALB/c小鼠，合格證號SCXK(川)2004-15，15月齡，將小鼠隨機分為2組，分別作為對照組、移植組，對照組20只小鼠，移植組20只小鼠。

1.3 實驗方法

1.3.1 胎鼠MSCs的提取 斷髓處死妊娠13.5 d的孕鼠，無菌取出胎鼠，去除胎鼠頭、尾、四肢及內臟，PBS洗滌數次，剪成約1 mm3大小組織塊，0.2%膠原酶Ⅳ于37℃消化60 min，混懸液過200目篩網，收集濾過液，PBS稀釋，離心，細胞沉淀再用PBS漂洗2次，懸浮細胞并計數，以1×106/cm2密度接種于含10%胎牛血清的DMEM-F12完全培養液的培養瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，3 h后全量換液，棄非貼壁細胞。待細胞融合達80%，用0.25%胰酶消化，按1∶3進行傳代。

1.3.2 胎鼠MSCs的鑒定 收集適量P3代細胞做鑒定。流式細胞儀檢測CD44、CD29、CD45等表面標志。成脂誘導分化實驗鑒定：以含5%胎牛血清的DMEM-F12加1 mol/L地塞米松、5 U/ml胰島素、200 μmol/L吲哚美辛、0.5%異丁基甲基黃嘌呤配制成脂肪誘導分化液，待觀察到胞漿中有脂滴形成時，油紅O染色鑒定。成骨誘導分化實驗鑒定：以含5%胎牛血清的 DMEM-F12 加 10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml抗壞血酸，誘導28 d后茜素紅染色鑒定。

1.3.3 移植胎鼠MSCs 移植組每只小鼠每次尾靜脈注射0.2 ml約107個P3代MSCs細胞，每月注射一次，連續注射3次;對照組每月注射一次等量PBS溶液，連續注射3次。

1.3.4 小鼠衰老狀態的觀察 首先總體觀察比較移植前后對照組和移植組小鼠的形態改變、精神狀況以及活動度。從對照組和移植組中各隨機選取10只小鼠于MSCs移植前以及移植3個月后，用Vevo770?高分辨率小動物超聲系統對其做心臟檢查。其中超聲測量指標為左室質量、心輸出量、每搏量、左室舒張期容積。處死小鼠，在心臟同一部位取材，石蠟切片心臟組織學檢查，評價組織衰老程度通過0～4分法雙盲打分〔3〕，按Y染色體原位雜交試劑盒說明書操作檢測石蠟切片中植入的干細胞是否有表達分化為心肌細胞或血管內皮細胞。

1.4 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件，采用兩獨立樣本的t檢驗。

2 結果

2.1 MSCs鑒定結果 原代胎鼠細胞呈梭形貼壁生長，有較多的集落形成，生長速度快，平均16 h傳代一次，第三代細胞形態比較均勻，集落較少。P3代細胞流式細胞儀檢測表面標志CD44、CD29陽性率達98%，CD45陰性率達95%。P3代細胞做成脂、成骨誘導分化實驗證明移植的細胞為MSCs。成脂油紅O染色結果，可見胞漿中有大量被染成鮮紅色的小脂滴。成骨茜素紅染色結果，細胞質被染成紅色的鈣結節隨處可見。見圖1。

2.2 移植后小鼠總體改變 移植后未發現MSCs移植對小鼠造成明顯不良影響，并且觀察到移植組小鼠的體力活動、精神狀態、毛發光澤度優于對照組。移植前以及移植3個月后兩組小鼠體重均無統計學差異。

2.3 植入細胞的轉歸 移植3個月后的小鼠Y染色體原位雜交未在心臟組織中檢測到植入的MSCs。

2.4 超聲心動圖情況 對照組和移植組在實驗3個月后相對于實驗前的心臟超聲測量各指標的改變量都存在統計學差異。見圖2，表1。

2.5 組織學檢查結果 移植3個月后，對照組與移植組心臟組織學衰老程度相比，對照組心臟心肌病樣改變明顯，心肌間質廣泛纖維化，心肌脂肪變性，細胞質玻璃樣變，細胞質空泡形成;肌纖維大小不一，肌小節斷裂，異位鈣化，小動脈硬化，充血性心力衰竭樣改變明顯。見圖3。

表1 兩組小鼠左心室重量、心輸出量、組織衰老程度評分、左心室舒張末期容量等指標的比較(± s，n=10)

表1 兩組小鼠左心室重量、心輸出量、組織衰老程度評分、左心室舒張末期容量等指標的比較(± s，n=10)

與對照組比較：1)P＜0.05

組別 左室重量(mg) 心輸出量(ml/min) 梗死體積(μl) 左室舒張末容量(μl) 心臟指數(%) 心肌病理嚴重程度(score)對照組 19.34±9.73 12.95±2.76 12.76±7.25 9.46±4.050.55±0.05 1.60±1.13移植組 11.34±6.721) 7.50±2.651) 6.89±4.901) 5.50±2.321) 0.49±0.081) 2.60±0.911)

圖1 MSCs鑒定結果

圖2 兩組超聲心動圖左室舒張期容積

圖3 移植后對照組和移植組小鼠心臟組織學對比(×20)

3 討論

胎鼠MSCs具有多向分化潛能，屬于多能造血干細胞，因為容易體外培養、高度擴增能力，多分化潛能、免疫原性低等優勢，被廣泛運用于細胞替代治療和細胞支持治療，大量的實驗和臨床研究證明其巨大的運用前景〔4，5〕。我們上述實驗已通過表面CD分子的流式細胞儀測定、成脂油紅O染色和成骨茜素紅染色實驗鑒定了我們的實驗細胞為 MSCs。從理論上講，MSCs可以無限增殖、生長，但 Wagner等〔6〕報道人 MSCs培養7～12代出現衰老，大鼠骨髓MSCs培養到10代以后也開始有衰老現象，其增殖能力和成骨分化能力隨著年齡的增加而降低。本實驗表明移植胎鼠MSCs能有效地延緩小鼠心血管系統自然衰老進程。15月齡的小鼠(小鼠平均壽命為19個月)的心血管系統存在著一系列的老年性小鼠心血管系統衰老變化：心肌細胞纖維化，脂褐素沉積，膠原增多，淀粉樣變;心臟瓣膜退行性變和鈣化;心肌的興奮性、自律性、傳導性均降低;動脈硬化，彈性纖維和膠原纖維失衡，彈性作用明顯減弱;心肌收縮力減弱、心輸出量減少，總外周阻力增加，組織毛細血管密度降低等。而超聲心動圖顯示移植組左室舒張期容積、每搏輸出量、心肌收縮力均明顯高于對照組，移植組小鼠心臟組織學更是呈現相對年輕化改變，對照組小鼠心肌間質纖維化，心肌脂肪變性，細胞質玻璃樣變，細胞質空泡形成程度都更明顯更嚴重。

然而，移植3個月后的小鼠心肌組織切片Y染色體原位雜交結果表明，在心臟組織中僅檢測到數個植入的胎鼠MSCs源性的心肌細胞。這與組織選擇性差，MSCs被分散到血流經過的任何部位，最主要是與肺組織的截留有關。但很明顯移植MSCs的抗小鼠衰老作用與細胞替代作用關系不大。在生理狀態下，MSCs在組織細胞中起著重要的支持調節作用，如造血系統衰老的重要原因是MSCs的衰老，向脂肪細胞分化增加，分泌重要細胞因子和生長因子的能力下降，造血微環境穩態調控能力的下降，甚至抑制造血使之不能滿足機體需要〔7〕。因此補充MSCs低氧條件培養液以補充各種細胞因子對小鼠造血系統的自然衰老有抑制作用〔8〕。同樣，本實驗中MSCs影響小鼠心血管系統自然衰老進程的機制考慮可能與MSCs分泌多種細胞因子改變心肌細胞、血管內皮細胞的微環境有關，如有文獻報道心肌梗死后輸注MSCs條件培養液可以減少心肌損傷〔9〕，心肌梗死后MSCs通過旁分泌多種細胞因子和復雜的信號通路發揮作用〔10〕。

雖然有文獻報道移植MSCs不能改善心肌梗死后的心律失常和代謝紊亂〔11〕。但是綜上所述本實驗得出較明顯結論：移植胎鼠MSCs有明顯的抗小鼠心血管衰老作用，且與MSCs分泌的多種細胞因子有關。另外，MSCs的衰老與腫瘤、慢性心衰、肌萎縮、肺纖維化、骨關節等疾病以及機體、組織器官的衰老密切相關。本課題組前期實驗〔12～14〕證明：補充臍帶MSCs能有效的抑制小鼠自然衰老進程，如抑制骨髓的脂肪化的進程，造血系統衰老的進程等，這為老年股骨頭壞死、骨質疏松癥等骨髓過度脂肪化疾病以及老年性的各種體質衰落、老年性疾病治療提供了新的思路。而本實驗移植對于小鼠無免疫性的胎鼠MSCs，也能起到抗小鼠心血管自然衰老的作用。從MSCs衰老的多種原因出發或者不斷補充外源性MSCs以維持MSCs自身平衡，從而起到抗細胞衰老作用，對這一系列老年性疾病的治療和改善中老年人的生活質量有著重要意義。

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