柴胡注射液對內毒素大鼠彌散性血管內凝血多器官損傷的影響及作用機制

朱海龍 張根葆 張 翠 (南京醫科大學附屬江寧醫院，江蘇 南京 200)

彌散性血管內凝血(DIC)是以機體凝血系統功能紊亂為特征，以出血、貧血、休克、多器官損傷為表現的危急重癥。內毒素可通過誘導單核細胞、內皮細胞釋放腫瘤壞死因子(TNF)、白介素(IL)-1、IL-6等細胞因子而激活凝血系統，最終誘發DIC〔1〕。DIC時微血栓的大量形成，以及炎癥損傷，又可促進多器官功能障礙綜合征(MODS)的發生〔2，3〕。調查顯示，當DIC伴發多器官功能損傷時患者病死率將明顯增高〔4〕。因此加強DIC多器官損傷的防治研究，對降低患者病死率具有十分重要的意義。柴胡為傳統中藥材，其主要成分柴胡皂苷具有抗炎、保肝的功效〔5〕。為了進一步了解柴胡對內毒素DIC多器官損傷的影響，本研究以大鼠為對象，建立內毒素DIC多器官損傷模型，初步探討柴胡的防治功效及作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 脂多糖(LPS，E coli 055：B5，美國Sigma公司)，柴胡注射液(咸陽泰鑫藥業有限公司)，APTT及FIB測定試劑盒(上海太陽生物技術有限公司)，磷酸化ERK1/2兔抗鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG抗體(美國Santa Cruz公司)，其他試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器 MC-2000型全自動血凝儀(德國MDC公司)，Au400型全自動生化儀(日本Olympus公司)，BX41型雙目顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 實驗動物 SD大鼠，32只，雌性，體重210～230 g，由南京青龍山動物繁殖場提供。

1.4 方法

1.4.1 造模 32只SD大鼠隨機分為4組：對照組、模型組和柴胡低、高劑量組。參考文獻〔6〕的方法，略加改動復制大鼠DIC模型，具體步驟為：大鼠空腹12 h后，對照組腹腔注射生理鹽水4 ml/kg，模型組腹腔注射6 mg/kg LPS，柴胡低、高劑量組分別腹腔注射0.2，0.4 g/kg柴胡注射液和6 mg/kg LPS。

1.4.2 實驗室檢查 各組大鼠在藥品注射結束后5 h時，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉。頸總動脈插管取血，并用3.8%枸櫞酸鈉1∶9抗凝。離心后取血漿，利用MC-2000血凝儀及Olympus Au400生化儀測定活化部分凝血活酶時間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、尿素(BUN)及肌酐(CRE)等指標。

1.4.3 標本采集 各組大鼠取血后，立即留取心、肝、腎等臟器，甲醛固定、石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下檢查各臟器組織病理變化。同時行免疫組化檢測肝組織中磷酸化細胞外信號調節激酶1/2(p-ERK 1/2)的分布，具體步驟如下：病理切片常規脫蠟至水，微波修復，羊血清封閉，兔抗鼠磷酸化ERK1/2單克隆抗體1∶200稀釋，37℃孵育1 h，4℃ 冰箱過夜，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗37℃ 孵育1 h，DAB顯色。結果判斷：胞核和/或胞質中呈棕黃色為陽性細胞。

2 結果

2.1 各組凝血及生化指標變化 與對照組相比，模型組各凝血及生化指標變化顯著(P＜0.01);與模型組相比，柴胡低劑量組各生化指標均顯著下降(P＜0.01)，凝血指標APTT也有所改善(P＜0.05)，而FIB的變化無統計學意義;柴胡高劑量組凝血及生化指標均較模型組顯著改善(P＜0.01)。見表1、表2。

2.2 各組織病理學變化 對照組心肝腎組織肉眼觀無明顯異常。模型組肝臟表面肉眼可見廣泛點狀出血;光鏡下可見心內膜下片狀出血，部分肝細胞水腫變性，肝細胞索排列紊亂，肝竇及間質血管擴張充血，腎小球及間質血管擴張充血，腎小管上皮細胞水腫變性。與模型組相比，柴胡低、高劑量組心肝腎等臟器結構基本趨于正常，充血出血明顯減輕。見圖1～圖3。

2.3 p-ERK 1/2蛋白在肝組織中的分布 ERK1/2主要為胞質陽性，對照組未見p-ERK1/2陽性表達。模型組則陽性細胞明顯增多，廣泛分布于肝細胞。柴胡低、高劑量組陽性細胞密度較模型組明顯降低。見圖4。

表1 4組大鼠凝血指標變化(± s，n=8)

表1 4組大鼠凝血指標變化(± s，n=8)

與對照組比較：1)P ＜0.01;與模型組比較：2)P ＜0.05，3)P ＜0.01

組別 劑量(g/kg) APTT(s) FIB(mg/dl)對照組 －20.51±0.88 423.63±6.04模型組 － 45.35±2.081) 54.75±3.491)柴胡組 0.2 38.69±1.631)2) 52.88±1.941)0.4 37.34±1.201)3) 170.25±9.571)3)

圖1 4組大鼠心臟組織病理變化(HE，×100)

圖2 4組大鼠肝組織病理變化(HE，×100)

圖3 4組大鼠腎組織病理變化(HE，×100)

圖4 肝組織p-ERK1/2免疫組織化學結果(IHC，×100)

表2 4組大鼠血生化指標變化(± s，n=8)

表2 4組大鼠血生化指標變化(± s，n=8)

與對照組比較：1)P＜0.01;與模型組比較：2)P＜0.01

組別 劑量(g/kg) LDH(U/L) ALT(U/L) AST(U/L) BUN(mmol/L) CRE(μmol/L)對照組 － 109.88±12.55 28.65±1.95 59.50±2.97 4.30±2.00 45.78±1.55模型組 － 2 472.00±66.511) 897.71±24.851) 517.88±7.111) 11.30±0.341) 85.53±1.781)柴胡組 0.2 354.88±18.311)2) 45.01±1.641)2) 175.88±8.431)2) 9.03±0.401)2) 61.76±2.061)2)0.4 225.50±8.051)2) 41.49±3.201)2) 131.75±4.311)2) 8.63±0.241)2) 54.30±1.291)2)

3 討論

DIC是因凝血系統過度激活，繼而出現凝血功能障礙，最終引起出血傾向的臨床病理過程。與國外不同，在我國引起DIC的首要因素為感染，約占30% ～40%，其中又以革蘭陰性細菌感染最為多見，約占65%。內毒素(ET)是革蘭陰性細菌(G－)的主要致病成分。內毒素通過誘導單核細胞、內皮細胞釋放TNF、IL-1、IL-6 等炎癥因子而激活凝血系統，最終引發 DIC〔1〕。同時，炎癥因子所誘發的炎癥反應又可對各種組織器官造成損傷，再者DIC微血栓形成所造成的微循環失衡，嚴重時也可導致或促進MODS的發生〔2，3〕。MODS是一個以上器官功能發生障礙甚至衰竭，其預后較差。調查顯示，任何單一器官系統持續衰竭24 h以上的死亡率約10%，兩個系統以上衰竭的死亡率為60%，若涉及三個系統衰竭＞72 h以上者，死亡率近100%。國外文獻報道：美國所有入住 ICU的病人，約80%病人死于MODS〔4〕。因此加強DIC多器官損傷的防治研究，有著重要的現實意義。

柴胡注射液以柴胡一味中藥，經提煉而成。柴胡為傳統中藥材，其成分主要為柴胡皂苷、甾醇、揮發油等，其中又以柴胡皂苷最具生物活性。國內外的眾多研究表明柴胡皂苷具有解熱、抗炎、免疫調節及保肝等功效〔6〕。本研究采用內毒素來復制DIC多器官損傷模型，模型組各項凝血及生化指標較對照組明顯改變，各器官組織擴張充血明顯，符合動物DIC診斷標準。柴胡注射液處理后各器官功能指標均顯著改善，形態學可見各臟器損傷減輕。這表明柴胡能夠減輕內毒素所致的DIC多器官損傷。

有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是生物體內重要的炎癥信號轉導系統之一，到目前為止已有4種MAPK亞家族被發現，分別為細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基未端激酶(JNK)等。這些MAPK亞家族成員能被多種炎性刺激所激活，并對炎癥的發生、發展起重要調控作用。有報道顯示〔7〕，柴胡皂苷d能夠抑制Jun氨基末端激酶(MAPK家族成員)的磷酸化，這提示柴胡的抗炎機制與炎癥信號通路的抑制有關。Dang等〔8〕研究證實，柴胡皂苷d可能通過對NF-κB炎癥通路的抑制，而減少TNF-α、IL-6等細胞因子的釋放。與文獻報道相似，本實驗免疫組化顯示模型組肝組織陽性細胞密度較高，而柴胡組陽性細胞密度減低，這提示柴胡可能具有干擾ERK1/2炎癥通路的作用。我們此前的研究表明ERK 1/2信號通路與內毒素DIC的凝血功能紊亂及多器官損傷過程具有相關性，阻斷ERK1/2信號通路對內毒素DIC大鼠的器官損傷具有保護作用。這提示柴胡可能通過抑制ERK1/2炎癥通路，進而減輕內毒素DIC的器官損傷。然而ERK1/2信號通路涉及多個環節，多種激酶的磷酸化，其具體機制有待進一步的研究。

綜上所述，本研究提示柴胡注射液可以減輕內毒素DIC的多器官損傷，其機制可能與ERK1/2信號通路的阻斷有關，這為內毒素DIC多器官損傷的臨床防治提供了實驗資料。

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6 劉彥琴，陳諭寧，周 凡，等.內毒素致大鼠凝血功能改變的實驗研究〔J〕. 中國實用內科雜志，2007;27(S1)：108.

7 Leung CY，Liu L，Wong RN，et al.Saikosaponin-d inhibits T cell activation through the modulation of PKCθ，JNK，and NF-κB transcription factor〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;338(4)：1920-7.

8 Dang SS，Wang BF，Cheng YA，et al.Inhibitory effects of saikosaponin-d on CCl4-induced hepatic fibrogenesis in rats〔J〕.World J Gastroenterol，2007;13(4)：557-63.