金雀異黃素抑制大鼠膀胱腫瘤作用的實驗研究

李晶磊，何朝宏，許長寶

(鄭州大學第二附屬醫院泌尿外科 450014)

膀胱腫瘤是中國發病率最高的泌尿系腫瘤，有逐年增多的趨勢[1]。金雀異黃素是來源于豆類植物異黃酮類化合物,是大豆異黃酮的主要活性成分。近年來研究表明金雀異黃素具有抑癌及防癌作用，對乳腺癌、前列腺癌及結直腸癌等多種腫瘤細胞株都具有抑制作用[2-5]，但對膀胱腫瘤的作用研究較少，本實驗通過研究金雀異黃素對N-甲基亞硝基脲(MNU)誘導的SD大鼠膀胱腫瘤的抑制作用，以期為膀胱腫瘤的治療提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級飼養的7～8周SD大鼠60只，雌雄各半，體質量100～160 g,由鄭州大學實驗動物中心提供(許可證號:2010B070)。飼養條件:YX型實驗動物潔凈柜飼養,常規濕度(40%～50%),溫度(22±2)℃。

1.2試劑 MNU購于美國Sigma公司，以pH 6.0的枸櫞酸緩沖液為溶劑,配成濃度為20 mg/mL的誘導液,―20 ℃儲存備用。金雀異黃素純度大于或等于98%，相對分子質量為270.2，分子式C15H10O5，為白色粉末狀，購于陜西慧科生物股份有限公司(批號：KHT2088766)。將金雀異黃素溶于75%乙醇，濃度為10 mg/mL儲存液，使用生理鹽鹽水稀釋，乙醇最終濃度應低于0.75%。

1.3實驗分組 按雌雄平分的原則隨機分成3組，對照組、實驗1組和實驗2組，各20只。按照劉紅耀等[6]利用MNU誘導制備大鼠膀胱腫瘤的方法，在各組大鼠膀胱內注入0.1 mL MNU誘導液(20 mg/mL)，每2周1次,共灌注5次。同時實驗1組和實驗2組的大鼠經腹腔內注射金雀異黃素，劑量分別是：實驗1組0.5 mg/kg,實驗2組1.0 mg/kg，每2日1次，連續給藥10周；對照組用同樣的方式注射生理鹽水。15周時，乙醚麻醉處死動物,完整切取膀胱,切開膀胱，觀察黏膜形態,記錄腫瘤數目,用游標卡尺測量腫瘤直徑，精密秤稱質量，石蠟包埋,切片HE染色病理分析。

1.4觀察指標 每日觀察并記錄大鼠的飲食及活動一般情況，給藥前稱體質量并記錄。經腹腔給藥時因操作失誤，實驗1組和實驗2組各死亡1只大鼠，在實驗過程中，死亡的大鼠，不在統計之列。實驗結束時，剝取腫瘤組織稱腫瘤質量，按以下公式計算各組抑瘤率(IR)：IR=(對照組腫瘤質量―實驗組腫瘤質量)/對照組腫瘤質量×100%

1.5統計學處理 用SPSS 11.5軟件進行分析,計量資料采用方差分析，計數資料采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1實驗前、后大鼠體質量變化情況 各組大鼠實驗前、后體質量減少情況見表1。

表1 各組大鼠實驗前、后體質量減少情況

a:P<0.05，與對照組比較。

表2 各組大鼠膀胱成瘤情況

a:P<0.05，與對照組比較。

2.2各組大鼠膀胱成瘤情況 對照組有19只大鼠膀胱有腫瘤形成(成瘤率95.00%)，主要表現為結節形、菜花狀，多為數個結節，并伴有出血潰瘍。實驗1組有8只大鼠膀胱有腫瘤形成(成瘤率68.00%)，表現為結節狀，無潰瘍形成；而未形成腫瘤的6只大鼠膀胱黏膜表現出空虛狀、增厚、粗糙。實驗2組有12只大鼠膀胱有腫瘤形成(成瘤率63.00%),腫瘤均為小結節狀；而未形成腫瘤的7只大鼠膀胱膜黏色澤鮮艷、粉紅、內壁粗糙、輕度增厚。見表2。

2.3各組大鼠膀胱所形成腫瘤體積、質量和抑瘤率比較 實驗1組、實驗2組在腫瘤體積和質量上和對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；實驗1組在腫瘤體積和質量上與實驗2組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠膀胱所形成腫瘤體積、質量和抑瘤率比較

-：表示此項無數據；a:P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與實驗1組比較。

2 討 論

本實驗利用的MNU誘導的60只SD大鼠膀胱腫瘤方法是目前研究膀胱腫瘤比較常用和標準的方法，具有意外死亡率低、感染率低、誘癌時間短、病理類型中的移行細胞癌比例較高及更接近于人類的膀胱腫瘤等特點[7]。膀胱腫瘤是泌尿系統中最常見的腫瘤，腫瘤細胞侵襲力很強，易復發和轉移，研究可用于預防、診治膀胱腫瘤的方法，具有重要的臨床價值和科研意義[8]。

金雀異黃素是酪氨酸激酶抑制劑的一種，酪氨酸激酶抑制劑作為一大類抗腫瘤藥物,在基礎和臨床研究中越來越受到人們的重視[9-10]。金雀異黃素抑制了膀胱組織生長因子的受體酪氨酸激酶,特別是抑制表皮生長因子受體(EGF-R)和血小板衍生的生長因子受體(PDGF-R)酪氨酸激酶的活性,卻很少影響絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的活性,能競爭性地抑制ATP結合到酪氨酸激酶催化結構域,從而特異地抑制酪氨酸激酶的活性[11-13],這一性質會減少生長因子對非正常細胞刺激而避免過度增生，從而使腫瘤組織在體積上和質量上減輕。本實驗中可以看出，金雀異黃素抑制MNU誘導的大鼠膀胱腫瘤的作用較明顯，主要表現在金雀異黃素能夠延緩患瘤大鼠體質量的下降，使腫瘤的體積、質量、數量減少，也能使腫瘤的成瘤率下降。雖然不同劑量金雀異黃素之間在抑制腫瘤的數量、體積等方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，但是在病理分級中，劑量大的金雀異黃素組能明顯降低成瘤率,劑量越大，抑癌作用越強。

在膀胱腫瘤的血管形成過程中金雀異黃素能夠減少血管內皮細胞分泌堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasmIn ogen activator，uPA)[14-15]，抑制膀胱腫瘤發展過程中微血管的形成，降低膀胱腫瘤血管密度(MVD)，從而減緩腫瘤的發展。

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