謝氏丙酸桿菌發酵廢液中生物抑菌物質的研究

盧 楠，朱文華

（1.河北化工醫藥職業技術學院制藥工程系，河北石家莊 050026；2.石家莊科技信息職業學院醫藥化工系，河北石家莊 050091）

謝氏丙酸桿菌發酵廢液中生物抑菌物質的研究

盧 楠1，朱文華2

（1.河北化工醫藥職業技術學院制藥工程系，河北石家莊 050026；2.石家莊科技信息職業學院醫藥化工系，河北石家莊 050091）

對生產維生素B12的謝氏丙酸桿菌發酵廢液中是否存在生物抑菌物質，其性質、抑菌作用大小及抗菌譜進行了研究。研究表明，謝氏丙酸桿菌的發酵液針對檢驗菌的抑菌效果明顯優于化學防腐劑且抑菌譜較廣，可以抑制一些革蘭氏陽性菌、陰性菌及真菌，其中主要抑菌成分為等電點在2.0附近的蛋白類物質、丙酸氨、乙酸氨。

生物抑菌物質；發酵液；抑菌作用；抑菌譜

目前，中國食品防腐劑主要采用苯甲酸鈉及山梨酸鉀，在食品中加入化學防腐劑雖可延長食品保質期，但會影響人類健康［1］，且添加后使食品產生澀味。生物殺菌素是由微生物代謝產生的抗菌物質，主要是一些有機酸、多肽或者前體多肽，分子質量小，結構高度緊密。其作用機制主要是在細胞膜上形成微孔，導致膜通透性增加，產生系統破壞。生物殺菌素能迅速抑制微生物的生長，具有低毒、高效、選擇性強、抗菌譜較寬、熱穩定性好、適用pH值范圍廣、使用過程不易產生抗性菌、殘留時間短、對環境污染小等特點，并且從微生物發酵液中提取抗菌物質成本低、周期短、操作方便，容易實現工業化生產，因此可以發揮更大的工業應用價值［2］。常見的生物殺菌素有放線菌素（溶菌酶、納他霉素、泰樂菌素）、細菌素（乳酸鏈球菌素、乳品丙酸桿菌素）。丙酸桿菌和乳酸菌產生的細菌素在食品防腐劑方面也具有很大的應用潛力［3］。維生素B12厭氧發酵的生產菌是謝氏丙酸桿菌，在代謝細胞內產物維生素B12的同時，發酵廢液還應含有細菌素類物質及丙、乙酸鹽類，都具有生物抗菌作用，可作為天然、綠色、安全的食品和飼料防腐劑［4］。筆者對謝氏丙酸桿菌發酵液中是否存在生物抑菌物質，其性質、抑菌作用大小及抗菌譜進行了研究，并將其抑菌效果與常用的化學防腐劑的抑菌效果進行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測菌菌種

枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，啤酒酵母，黑曲霉。

1.1.2 檢測菌培養基

牛肉膏蛋白胨培養基（細菌培養基），酵母菌，霉菌高糖培養基。

1.1.3 實驗儀器

JJ200型精密電子天平，HHBⅡ型電熱恒溫培養箱，TGL－16C型臺式離心機，SW－CY－2FD型潔凈工作臺，RE－52型旋轉蒸發器，HYG－A型全溫搖瓶柜。

1.1.4 實驗試劑

葡萄糖，濃鹽酸，濃氨水，丙酸，NaOH，NaCl，乙酸，雙乙酸鈉，硫酸銨，苯甲酸鈉，100mmol/L磷酸緩沖液，均為分析純；酵母提取物，牛肉膏，瓊脂，胰蛋白胨，考馬斯亮藍，蛋白酶K，蛋白酶，均為生化試劑；維生素B12發酵液，河北華榮制藥有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 待檢菌種菌懸液的制備

將檢測菌活化后置于4℃冰箱內保存待用，配置培養基，包扎、滅菌，在適宜條件下培養待檢菌種，制備各待檢菌種菌懸液。

1.2.2 待檢液制備

用發酵液分別配制以下編號的檢測液。1＃：濃縮10倍的發酵液；2＃：濃縮20倍的發酵液；3＃：與10倍濃縮發酵液中丙乙酸濃度相等的丙乙酸鈉混合液；4＃：與20倍濃縮發酵液中丙乙酸濃度相等的丙乙酸鈉混合液；5＃：未經濃縮處理的發酵液原液；6＃：與發酵液原液中丙乙酸濃度相等的丙乙酸鈉對照液；7＃：雙乙酸鈉對照液（樣品濃度超過使用濃度的4倍）；8＃：苯甲酸鈉對照液（樣品濃度超過使用濃度的4倍）；9＃：HCl對照液；10＃：與10倍濃縮發酵液中丙乙酸濃度相等的丙乙酸氨混合液；11＃：與20倍濃縮發酵液中丙乙酸濃度相等的丙乙酸氨混合液；12＃：10倍濃縮發酵液經濃HCl處理后的上清液；13＃：10倍濃縮發酵液經濃HCl處理后所得沉淀物的磷酸緩沖溶液；14＃：10倍濃縮發酵液經濃氨水處理后的上清液；15＃：10倍濃縮發酵液經濃氨水處理后所得沉淀物的磷酸緩沖溶液；16＃：20倍濃縮發酵液經濃HCl處理后的上清液；17＃：20倍濃縮發酵液經濃HCl處理后所得沉淀物的磷酸緩沖溶液；18＃：20倍濃縮發酵液經濃氨水處理后的上清液；19＃：20倍濃縮發酵液經濃氨水處理后所得沉淀物的磷酸緩沖溶液。由于抑菌成分在pH值為5.5時抑菌效果最明顯，故以上液體均將pH值調節至5.5。

1.2.3 檢測菌平板制備

將平板滅菌待用，取適量待檢測菌種菌懸液混菌倒在平板上。待培養基凝固后，用鑷子將無菌棉紙片（厚度為0.5cm）貼于平板相應標記處，取等量待檢測液體，放在棉紙片上。將平板放在適宜條件（細菌，37℃；酵母菌、霉菌，28℃）培養1d，觀察是否有抑菌圈出現及其抑菌圈大小，以此來確定其是否有抑菌作用及其作用大小。

1.2.4 發酵液抑菌成分及抑菌作用的研究

1）對比發酵液抑菌成分與常規化學防腐劑抑菌效果：選擇常規食品防腐劑雙乙酸鈉、苯甲酸鈉作為對照樣，樣品濃度超過使用濃度的4倍，對檢測菌菌種進行抑菌試驗。

2）判斷抑菌成分是否為發酵產物中的丙酸氨或乙酸氨：以丙酸氨和乙酸氨溶液為對照樣，濃度分別相當于10倍濃縮液和20倍濃縮液中丙酸氨和乙酸氨的濃度，用檢測菌菌種進行抑菌試驗。

3）排除用于樣品處理的鹽酸、磷酸緩沖液的影響：以相同濃度的且pH值為5.5的鹽酸、磷酸緩沖液為對照品，用檢測菌菌種作抑菌試驗。

4）等電點沉淀物性質的確定：將10倍、20倍發酵濃縮液，分別用濃HCl調節pH值為2.0，有沉淀產生。離心后，將沉淀用pH值為5.5、濃度為25 mmol/L的磷酸緩沖液溶解，其濃度以沉淀物恰好溶解為宜，待測。將10倍、20倍發酵液用濃氨水調節pH值為8.5，有沉淀產生。離心后，將沉淀用pH值為5.5、濃度為25mmol/L的磷酸緩沖液溶解，濃度以沉淀物恰好溶解為宜，待測。上清液用濃HCl調節pH值為5.5，待測。上述2類沉淀分別用考馬斯亮藍法測定，結果見圖1和表1。

圖1 枯草芽孢桿菌為檢測菌的抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic effect of bacillus subtilis for detection

表1 不同檢測菌上各檢測液的抑菌圈直徑大小Tab.1 Antibacterial circle diameter on different bacteria of different detection liquid cm

2 結果與討論

以枯草芽孢桿菌為例，結果分析如下。

1）由圖1可以看出：針對于枯草芽孢桿菌，發酵原液略有抑菌作用，發酵液10倍濃縮液有一定的抑菌作用，發酵液20倍濃縮液抑菌效果較好。由此可以得出：隨著發酵液濃縮倍數的提高，其抑菌效果不斷增強。但濃縮倍數太大，所耗費的時間和資源也相應增大，從經濟角度上是不可取的。常規食品防腐劑，即便濃度為使用濃度的4倍依然沒有明顯的抑菌效果。可見，發酵液中的抑菌物質抑菌效果遠高于常規化學防腐劑。

2）上清液對4種菌都有抑菌作用，丙酸氨、乙酸氨混合液對照對4種菌也有抑菌作用，說明發酵液中的丙酸氨和乙酸氨有抑菌作用，抑菌譜較廣，可以抑制一些革蘭氏陽性菌和陰性菌，還有真菌。

3）對照樣鹽酸和磷酸緩沖液均沒有抑菌圈，從此排除了酸和磷離子的影響。

4）經考馬斯亮藍溶液對堿性沉淀物和酸性沉淀物進行定性分析，溶液由棕黑色變為藍色，基本確定2種沉淀物均為蛋白類物質。

在其他檢測菌的實驗中，各待檢液的抑菌效果也出現與枯草芽孢桿菌類似的結果。上述分析表明：謝氏丙酸桿菌的發酵液針對檢驗菌的抑菌效果明顯優于化學防腐劑且抑菌譜較廣，可以抑制一些革蘭氏陽性菌和陰性菌，還有真菌。其中主要抑菌成分為等電點在2.0附近的蛋白類物質、丙酸氨、乙酸氨。

3 結 語

通過不同檢測菌平板，觀察各種待檢物質所產生的相應抑菌圈的有無及大小來判斷抑菌效果及抑菌譜，得出如下結論：發酵液原液的抑菌作用不明顯，但是濃縮后抑菌效果明顯增強；發酵產物中的丙酸氨、乙酸氨具有明顯的抑菌作用。經調酸處理得到的沉淀物抑菌作用明顯，抑菌譜也較廣，可以抑制一些革蘭氏陽性菌和陰性菌，還有真菌，經驗證此沉淀物為蛋白質類物質。發酵液中的復合抑菌物質的抑菌效果遠高于化學防腐劑的抑菌效果。

基于上述實驗結果，可以從丙酸菌厭氧發酵生產維生素B12的發酵廢液中分離提取高效廣譜的復合生物抗菌物質，并開發其市場應用價值。這樣在生產出高附加值產品的同時又避免了發酵廢水大量排放所造成的資源浪費及環境污染，不僅能夠滿足清潔生產、保護環境和促進人類健康的需要，又創造了可觀的社會財富，可謂一舉多得。

［1］熊 濤，樂易林.生物保鮮技術的研究進展［J］.食品與發酵工業，2004，30（2）：111－114.

［2］雷 虹.L－乳酸菌酸菜發酵液中小肽類天然防腐劑的研究［J］.中國林副特產，2005（2）：44－45.

［3］田文利，吳 瓊，呂紅線.乳酸鏈球菌素的研究進展［J］.食品工業，2000（3）：28－30.

［4］儀 宏，王麗麗，馮惠勇.丙酸積累對薛氏丙酸桿菌生長及產酸的影響［J］.微生物學通報，2003，30（3）：29－32.

Study on biological antibacterial material in fermentation liquor of propionibacterium shermanii

LU Nan1，ZHU Wen－hua2
（1.Department of Pharmaceutical Engineering，Hebei Chemical and Pharmaceutical Vocational Technology College，Shijiazhuang Hebei 050026，China；2.Department of Medicine and Chemical Industry，Science and Technology and Information College of Shijiazhuang，Shijiazhuang Hebei 050091，China）

Whether there is biological antibacterial material in the fermentation liquor of propionibacterium shermanii is studied，so are the nature，the antimicrobial effect and the antibacterial range.The results are as follows：The fermentation liquor has distinct inhibitory effect and wide antibacterial range comparing with chemical preservatives.The inhibitory effect is mainly for Gram－negative，Gram－positive bacteria and mildew.The effective antibiotic composition has protein ammonium propionate and ammonium acetate.at the isoelectric point of 2.0.

biological antibacterial material；fermentation liquor；antimicrobial effect；antibacterial range

TQ920.9

A

1008－1534（2012）03－0138－03

2012－02－21；

2012－03－12

張士瑩

盧 楠（1980－），女，河北石家莊人，講師，碩士研究生，主要從事發酵工藝、酶催化方面的研究和教學工作。