木素過氧化物酶的逆膠束純化研究

郭靈芝,袁興中*,曾光明,崔凱龍,黃華軍,梁運姍,方振敏,彭 馨 (1.湖南大學環境科學與工程學院,湖南 長沙 410082；2.湖南大學環境生物與控制教育部重點實驗室,湖南 長沙 410082；.湖南農業大學生物科學技術學院,湖南 長沙 410128)

木質素是由苯丙烷結構單元組成的近似球狀的復雜芳香族高聚體,其較難降解,已成為地球上碳循環的限速步驟[1].木素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶(laccase)構成木質素降解體系.其中,LiP在木質素降解過程中起關鍵作用[2].因此,研究LiP的純化方法,提高LiP酶活,對提高實驗研究水平、實現其工業化生產及加快木質素類廢棄物的資源化處理具有重要的意義.目前LiP的純化方法多采用鹽析沉淀、凝膠過濾層析、離子交換層析,這些方法存在操作時間長,不易放大的缺點[3].而逆膠束純化技術彌補了這些缺點,且具有成本低,可以重復利用等優點,有廣闊的工業應用前景,因此受到酶純化技術領域越來越多的關注[4].

逆膠束萃取技術是近年來發展起來的一種新型酶分離技術.逆膠束是溶解在有機溶劑中的表面活性劑在超過臨界膠束濃度時自發形成的聚集體[5].當含逆膠束的有機溶劑和蛋白質水溶液接觸時,蛋白質在靜電作用和疏水作用下進入有機相,然后再調節適當的條件,使蛋白質從有機相重新反萃取到水相中,以達到純化的目的.在萃取過程中,可以通過改變pH值、離子強度、表面活性劑種類和濃度等因素實現對目標酶的選擇性萃取,因此,萃取條件對純化效果起著至關重要的作用[6-7].同化學表面活性劑相比,生物表面活性劑是一種環境友好型的天然表面活性劑,具有可生物降解性、低毒性、生物相容性、低臨界膠束濃度,高增溶能力等優勢,因此,它的應用對于逆膠束純化技術有重要的意義[8-9].目前,對于生物表面活性劑構建的逆膠束純化功能酶的研究較少,而關于 LiP的生物表面活性劑逆膠束純化更是鮮有報道.

本研究以鼠李糖脂(RL)為表面活性劑構建逆膠束體系,并將其應用于LiP的萃取,通過改變表面活性劑濃度、離子強度、pH值以及振蕩時間等變量的取值,獲取一個最優萃取條件.并且對影響逆膠束體系純化過程的因素進行了全面的分析,以期為逆膠束萃取技術提純 LiP的工業推廣提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 黎蘆醇VA(Sigma試劑,96%);鼠李糖脂RL(實驗室自己制備);考馬斯亮藍 G250(Fluka進口,分析純);正己醇、異辛烷、無水乙醇和KCl等試劑均為市售分析純.

1.1.2 儀器 水浴恒溫振蕩器(WHY-2);紫外分光光度計(Shimadzu UV-2552, Japan);超聲波清洗儀;pH 計(PHS-2F,上海雷磁儀器廠); HZQ-C空氣浴振蕩培養箱;TGL-16G型離心機.

1.2 方法

1.2.1 LiP粗酶液的制備 菌株黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium(BKM-F-1767)購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心.

發酵培養基(L-1):葡萄糖10g,維生素 B11.5mg,酒石酸銨0.2g,Tween-800.05%,大量元素液 60mL,微量元素液25mL,酒石酸緩沖液10mmol/L,pH4.5.

大量元素液(L-1):CaCl20.792g,KH2PO420g,MgSO4·7H2O 6.25g.

微量元素液(L-1):CuSO4·5 H2O 10mg,氨三乙酸 1.5g,MnSO4·7H2O 0.5g,FeSO4·7H2O 100mg,KAl(SO4)210mg, H3BO310mg,NaCl 1.0g,ZnSO4·7H2O 100mg,CoSO4·7H2O 100mg.

制備方法:500mL錐形瓶中裝液體發酵培養基100mL,高壓滅菌后接種孢子(4×107個/100mL),37℃,150r/min搖床培養6d.培養液經紗布除去孢子和菌絲,10000r/min離心10min得到粗酶液.

1.2.2 萃取 將一定量的鼠李糖脂經超聲振蕩溶于正己醇/異辛烷(V:V為1:1)的混合液,形成逆膠束溶液.前萃是將 LiP粗酶液與逆膠束溶液等體積混合,振蕩一定的時間后以10000r/min離心10min,靜置分相,留取上層有機相.后萃是將前萃后所得的有機相和等體積的含一定離子強度的0.1mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液混合,振蕩30min,10000r/min離心 10min,靜置分相,留取下層水相.采用紫外分光光度法分別測定所得水相中的蛋白質含量和LiP酶活.

蛋白質萃取率(EE)定義為:后萃水相中的蛋白質含量與初始酶液中蛋白質含量的質量百分比.LiP酶活回收率(AR)定義為:后萃水相中酶含量與初始酶液中酶含量的百分比.純化倍數(PF)為后萃水相中比酶活與初始酶液的比酶活之比.

1.2.3 LiP酶活測定 取0.6mL待測酶液,同時加入0.6mL的10mmol/L藜蘆醇溶液,1.8mL 250mmol/L的酒石酸緩沖液(pH值為3.0),用0.03mL 40mmol/L的H2O2啟動反應,總體積3.0mL,25℃反應3min,在310nm波長下測定吸光度的變化.并以不加 H2O2的反應體系作空白樣.一個酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化藜蘆醇產生1μmol藜蘆醛所需的酶量.

1.2.4 蛋白質濃度的測定和電泳 水相中蛋白質濃度采用考馬斯亮藍染色分析法.聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中,不連續電泳中分離膠和濃縮膠的質量分數分別為12.5%和5%.電泳時,開始采用低電壓(80V),待樣品在濃縮膠部分濃縮后,再加大電壓(120V),待指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳.

2 結果與討論

2.1 水相酸堿度對萃取的影響

水相的pH值對萃取效率有明顯的影響, pH值能改變蛋白質的表面電荷,決定酶蛋白帶電基團的解離速率和所帶的靜電荷[10].圖1反映了前萃取水相pH值的變化對LiP萃取率的影響.前萃取條件:0.04mol/L KCl,2.75mmol/L RL, 30min;后萃取條件:pH值為6,0.5mol/L KCl.

圖1 前萃水相中pH對LiP酶活回收率、蛋白質萃取率及純化倍數的影響Fig.1 Effect of aqueous phase pH during forward extraction on LiP activity recovery and extraction efficiency and purification fold

由圖1可知,當pH值為2.0～3.0時,逆膠束體系對酶的萃取率與pH值成正比.在pH值為3.0時,LiP酶的回收率達到最大值 93%.因為逆膠束萃取過程中,靜電相互作用是直接推動力.對離子型表面活性劑,萃取需滿足蛋白質與表面活性劑極性頭所帶電荷相反,才能形成靜電吸引作用.RL為陰離子表面活性劑,形成的逆膠束內表面帶負電荷.當水相pH值小于蛋白質的等電點(pI)時,蛋白質分子帶凈正電荷,LiP的等電點為3.2～4.0[11].在前萃取過程中,pI和pH的差值越大,酶蛋白與逆膠束內表面極性頭的靜電引力作用就越強,萃取效果就越好[12].

當pH值繼續增大時,整個體系對蛋白質包括對 LiP的萃取率都下降.這是因為蛋白質分子與表面活性劑極性頭之間的靜電吸引力減弱造成的.但是,當酶液的pH＞pI時,酶分子帶負電荷時,仍有酶被提取進逆膠束,這說明除靜電作用外,蛋白質還可能依靠其他作用進入逆膠束體系,其中蛋白質的疏水作用被認為是最重要的原因[13].

圖2 后萃水相pH對LiP酶活回收率、蛋白質萃取率及純化倍數的影響Fig.2 Effect of aqueous phase pH during backward extraction on LiP activity recovery and extraction efficiency and purification fold

在后萃取過程中,pH值對萃取率的影響更為明顯,如圖 2所示.蛋白質是一種兩性電解質,若水相的pH值大于蛋白質的等電點,則蛋白質帶負電荷,它所帶的電荷與逆膠束內所帶的電荷性質相同,兩者之間的靜電斥力促使溶入逆膠束的蛋白質被萃取出來.

由圖2可知,隨著pH值的逐漸增大,酶活回收率和蛋白質萃取率持續增加.其中,pH值從5.0增大到6.0的過程中,酶活回收率急劇提高,在pH值為7.0處達到峰值.繼續增大pH值,整個萃取效果急劇變差,可能是由于LiP在堿性環境中活力下降造成的.相對于pH值為6.0而言, pH值為7.0時酶活回收率增長量較少,而蛋白萃取率提高量較多,因此其純化倍數反而不如pH值為6.0處高,綜合考慮萃取率和純化倍數,確定最佳pH值為6.0.

2.2 生物表面活性劑濃度對萃取的影響

配制不同濃度的RL逆膠束溶液,按照實驗方法中闡述的步驟進行前萃取和后萃取.其中,前萃取水相pH值為3.0,后萃水相pH值為6.0,其他條件同上,萃取結果如圖3所示.

圖3 前萃取RL濃度對LiP酶活回收率、蛋白質萃取率及純化倍數的影響Fig.3 Effect of RL concentration during forward extraction on LiP activity recovery and extraction efficiency and purification fold

由圖3可見,當RL的濃度低于2.75mmol/L時,隨著RL濃度的增加,蛋白質的萃取率和酶活回收率均有一定程度的增加,這是因為RL濃度的增加使得逆膠束的數量增加,從而增溶的蛋白質增多.LiP是一種相對而言較小的蛋白質(38～43kD),這使得LiP更加容易進入逆膠束體系,從而導致純化倍數的增加[14].當RL的濃度超過2.75mmol/L時,萃取效果開始變差.當表面活性劑濃度過高時,逆膠束聚集在一起使得微細胞間碰撞劇烈,從而導致逆膠束的變形.同時,隨著表面活性劑濃度的過度增加,在水含量不變的情況下,逆膠束的尺寸減小,增大了酶蛋白進入逆膠束中的阻力[4].類似的情況出現在溶菌酶[15]和納豆激酶[16]的逆膠束萃取中.因此,接下來的實驗選擇表面活性劑RL濃度為2.75mmol/L.

2.3 離子強度對萃取的影響

陽離子種類(K+,Na+)和濃度對陰離子表面活性劑形成的逆膠束溶液的萃取有明顯的影響,Leodidis等[17]指出,在相同的離子強度下,其影響程度遵循 K+＞Na+.本次實驗選取 K+作為陽離子,以KCl為典型代表研究離子強度對萃取的影響.前萃中離子強度對萃取效果的影響如圖 4所示,其他萃取條件同上.

圖4 前萃取KCl濃度對LiP酶活回收率、蛋白質萃取率及純化倍數的影響Fig.4 Effect of KCl concentration during forward extraction on LiP activity recovery and extraction efficiency and purification fold

離子強度對萃取率的影響主要是由離子對表面活性劑的表面電荷的靜電屏蔽作用所引起[18].在前萃實驗中發現,當鹽濃度過低時,有機相和水相不能很好地分層,在界面有懸浮物.在逆膠束萃取過程中,離子起到防止兩相間的乳化,并加速兩相間分離的作用,但離子強度太大,可抑制蛋白質的萃取,以至根本不能被萃取[13].從圖4可以看出,當KCl濃度低于0.04mol/L時,蛋白質萃取率和酶活回收率均隨著離子濃度的增大呈增長趨勢,但當KCl濃度高于0.04mol/L時,萃取效率急劇下降.這種現象主要是由于以下兩個原因:一是隨著離子濃度的增大,逆膠束內表面的雙電層變薄,表面活性劑極性基團之間的相互斥力減弱,逆膠束的內徑也隨之變小,從而導致蛋白質不易進入;二是逆膠束內表面雙電層變薄,減弱了帶正電的蛋白質與陰離子逆膠束內表面之間的靜電引力,從而導致蛋白質的萃取率下降[19].

圖5為前萃取KCl濃度為0.04mol/L時,后萃取過程中KCl的濃度對萃取率的影響.從圖5可看出,隨著KCl濃度的增加,酶活回收率和蛋白質萃取率都是先增加后降低,當 KCl濃度為0.5mol/L時,萃取效果最好.這樣的結果可由雙電層理論來解釋,當離子強度增大時,蛋白質與逆膠束表面之間的靜電引力減小,從而降低了酶蛋白在逆膠束中的溶解度,使之由有機相反萃取回水相[13].但是高的離子強度增加了離子向逆膠束體系遷移的傾向,影響蛋白質的溶解,甚至使得蛋白質從逆膠束中鹽析出來,導致蛋白質萃取率降低[19].

圖5 后萃取水相KCl濃度對LiP酶活回收率、蛋白質萃取率及純化倍數的影響Fig.5 Effect of KCl concentration during backward extraction on LiP activity recovery and extraction efficiency and purification fold

2.4 振蕩時間對萃取的影響

圖6 前萃振蕩時間對LiP酶活回收率、蛋白質萃取率及純化倍數的影響Fig.6 Effect of shaking time during forward extraction on LiP activity recovery and extraction efficiency and purification fold

由于逆膠束萃取酶蛋白時必須使酶與逆膠束充分接觸,達到萃取平衡需要一定的時間,故振蕩時間對LiP的純化會產生一定的影響.圖6表明,萃取率隨著振蕩時間的延長不斷提高,30min后萃取基本上達到了一個平衡狀態,蛋白質的萃取沒有明顯的變化.而LiP的萃取率稍微降低了一點,這可能是由于增溶在逆膠束里面的酶發生了構象上的改變,延長振蕩時間時,LiP有小部分失活[20-21].因此本實驗采用的振蕩時間為30min.

2.5 SDS-PAGE電泳分析

目前 LiP粗酶液初步提純的方法多為鹽析沉淀.有研究報道[3],硫酸銨鹽析方法提純 LiP粗酶液,純化效果不明顯,僅為1.6,而逆膠束體系在最佳條件下萃取LiP,純化倍數可達2.9.兩者都可以用于工業上粗酶液的初步提純,但是后者操作時間更短,約3h,成本更低且對環境污染更少.

本實驗將粗酶液和逆膠束溶液按最佳萃取條件進行前萃和后萃實驗.從圖7中可以看出,粗酶液的條帶分子量有兩條,通過逆膠束萃取后水相的電泳圖譜主要集中在40kDa左右,其中包含了所需要萃取的LiP和少量的雜蛋白.綜上可知,逆膠束萃取技術對 LiP粗酶液進行了初步的提純,取得了一定的效果.

圖7 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析Fig.7 SDS-PAGE analysis 1:mark; 2:粗酶液; 3:逆膠束萃取后水相

3 結論

3.1 由生物表面活性劑構建的逆膠束體系可用于純化木素過氧化物酶,且只需前萃和后萃兩步就可以達到純化的目的,具有提取時間短,可在室溫下進行等優點.

3.2 將陰離子生物表面活性劑鼠李糖脂溶于正己醇/異辛烷(V:V為1:1)的混合液所構建的逆膠束體系萃取 LiP,通過實驗確定了各因素的最佳水平:[RL]=2.75mmol/L,前萃pH 值為3.0,前萃[KCl]=0.04mol/L,振蕩時間為30min,后萃pH 值為6.0,后萃[KCl]=0.5mol/L.在此條件下,酶活回收率為93%,純化倍數為2.9,電泳分析證實了純化結果.

[1]Andrzej L, NamSeok C, Jolanta L, et al. Fungal laccase:properties and activity on lignin [J]. J. Basic Microbiol., 2001,41(4):185-227.

[2]Zeng G M, Yu M, Chen Y N, et al. Effects of inoculation with Phanerochaete chrysosporium at various time points on enzyme activities during agricultural waste composting [J]. Bioresour.Technol., 2010,101:222-227.

[3]楊金水,袁紅莉,陳文新.褐煤降解真菌-青霉菌 P6的胞外酶研究 [J]. 中國環境科學, 2004,24(1):24-27.

[4]Harikrishna S, Srinivas N D, Raghavarao K S M S, et al. Reverse micellar extraction for downstream processing of proteins/enzymes [J]. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2002,75:119-183.

[5]梁運姍,袁興中,曾光明,等.表面活性劑在逆膠束酶反應系統中的作用機制 [J]. 中國科學, 2011,31(5):763-772.

[6]Hagen A J, Hatton T A, Wang D I C. Protein refolding in reversed micelles [J]. Biotechnol. Bioeng., 2006,95:285-94.

[7]Dovyap Z, Bayraktar E, Mehmetoglu U. Amino acid extraction and mass transfer rate in the reverse micelle system [J]. Enzym.Microb. Technol., 2006,38:557-562.

[8]崔凱龍,袁興中,曾光明,等.生物表面活性劑用于逆膠束體系的構建及微水相條件優化 [J]. 中國環境科學, 2011,31(9):1444-1450.

[9]王偉偉,袁興中,曾光明,等.逆膠束體系中纖維素酶解特性研究[J]. 環境科學, 2010,31(9):2202-2207.

[10]李 凱,李成付.反膠束萃取精氨酸脫亞胺酶 [J]. 精細化工,2008,25(2):162-166.

[11]Aitken M D, Lrvine R L. Stability testing of ligninase and Mn-peroxidase frompHanerochaete chrysosporium [J].Biotechnol. Bioeng., 1989,34:1251-1260.

[12]Hebbar H U, Sumana B, Raghavarao K S M S. Use of reverse micellar systems for the extraction and purification of bromelain from pineapple wastes [J]. Bioresour. Technol., 2008,99:4896-4902.

[13]王金枝,曹學君.反膠束萃取技術分離胰激肽原酶 [J]. 中國生物工程雜志, 2007,27(3):93-99.

[14]Tonova K, Lazarova Z. Reversed micelle solvents as tools of enzyme purification and enzyme-catalyzed conversion [J].Biotechnol. Adv., 2008,26:516-532.

[15]Shin Y O, Rodil E, Vera J H. Selective precipitation of lysozyme from egg white using AOT [J]. Food Sci., 2003,68:595-599.

[16]Liu J G, Xing J M, Shen R, et al. Reverse micelles extraction of nattokinase from fermentation broth [J]. Biochem. Eng.,2004,21:273-278.

[17]Kinugasa T, Kondo A, Mouri E, et al. Effects of ion species in aqueous phase on protein extraction into reversed micellar solution [J]. Sep. Purif. Technol., 2003,31:251-259.

[18]Somnuk J, Eric P, David C S. The effect of demulsifiers on lysozyme extraction from hen egg white using reversed micelles[J]. Bioseparation, 2000,9(81):81-91.

[19]Alves J R S, Fonseca L P, Ramalhoa M T, et al. Optimisation of penicillin acylase extraction by AOT/isooctane reversed micellar systems [J]. Biochem. Eng., 2003,15:81–86.

[20]Melo E P, Carvalho C M L, Aires-Barros M R, et al. Deactivation and conformational changes of cutinase in reverse micelles [J].Biotechnol. Bioeng., 1998,58:380-387.

[21]Andrade M S, Costa S M B. Structural changes of α-chymotrypsin in reverse micelles of AOT studied by steady state and transient state fluorescence spectroscopy [J]. J. Mol.Struct., 2001(565/566):219-223.