甲醛對小鼠骨髓組織的毒性作用

柯玉潔,秦曉丹,李 蘭,張玉超,杜 娟,丁書茂 (華中師范大學生命科學學院,遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430079)

甲醛是室內主要的空氣污染物[1],世界衛生組織已將甲醛歸類為人類致癌物 A1類.流行病學調查發現,甲醛污染可能與白血病發生有關.骨髓組織是具有分化生成各種細胞的干細胞的能力動物器官組織,這些干細胞通過分化能生成各種專職血細胞.因此,骨髓對于維持機體的生命和免疫力非常重要,任何對骨髓產生毒害作用的因素都有可能對動物體的健康產生影響.Golden等[2]指出:甲醛作為潛在的人類白血病致病原,需要從多條路線上去求證其生物學合理性;其核心問題是:吸入和食入的甲醛能夠轉運到骨髓;到達骨髓的甲醛具有造血毒性.Zhang等[3]認為甲醛致白血病可能有3個機制:①同其他致白血病原因一樣,直接破壞骨髓中的干細胞;②破壞外周血中的造血干細胞或祖細胞,進而進入骨髓,最終導致白血病;③破壞鼻黏膜等組織中的多功能干細胞,通過血液進入骨髓,導致白血病的產生.因此,在甲醛和白血病相關性的研究中,骨髓組織就是一個非常重要的靶器官.本研究以氣態甲醛暴露為染毒方式,骨髓組織細胞為研究對象,從骨髓組織細胞分裂,DNA穩定性,DNA-蛋白質交聯(DPC)效應和相關基因表達等方面展開研究,探究甲醛暴露對骨髓細胞的毒性效應,以期對評估甲醛暴露是否能增加白血病發生的風險提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑及儀器

實驗動物為5周齡純系SPF級雄性昆明小鼠,購自湖北省預防醫學科學院動物實驗中心.

主要實驗試劑:10%甲醛溶液(Sigma 公司);Hoechst 33258熒光染料(Sigma公司).

實驗儀器:WH-2小型智能環境氣候艙(武漢市宇信科技開發有限公司);4160-2型甲醛測定儀(Interscan公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 染毒 實驗采用仿真式暴露染毒[4],將20只小鼠,隨機分為1個對照組和3個甲醛染毒組,每組 5只小鼠.染毒組在染毒缸中連續動態染毒72h,甲醛經 WH-2型小型智能環境氣候艙調配后,持續穩定地輸出濃度為0.5,1.0,3.0mg/m3的甲醛氣體.對照組為在相同條件下的玻璃缸中,吸入經過濾的新鮮空氣(甲醛濃度＜0.01mg/m3).染毒期間,小鼠自由進食和飲水.

1.2.2 制備骨髓細胞樣品 染毒結束后,頸椎脫臼處死小鼠,取出雙側股骨,制備骨髓細胞懸浮液后用血細胞計數板進行細胞計數,將細胞數量調節到106個/mL.

1.2.3 流式細胞術測定骨髓細胞的細胞周期 將固定好的骨髓細胞樣品處理后,上細胞流式儀,用488nm氬離子激光管,測前向、側向散色光和紅色熒光.數據記錄與分析.

1.2.4 隨機擴增多態性DNA標記(RAPD)檢測骨髓細胞的DNA穩定性 骨髓細胞的DNA基因組提取參照文獻[5]方法.按紫外吸收法用微孔板分光光度計的DNA Quant程序進行含量測定,制備0.7%的瓊脂糖凝膠進行電泳,用凝膠成像系統進行結果分析.

PCR反應體系為(50μL),之后進行RAPD程序流程.實驗所用8個隨機引物如表1所示.

表1 RAPD的隨機引物Table 1 List of RAPD primers

1.2.5 DNA-蛋白質交聯的檢測. DPC采用KCI—SDS沉淀法進行檢測.計算DPC系數η,以此值表示DNA和蛋白質的交聯程度.η計算公式為:

式中:DPC定量得先制作DNA濃度的標準曲線(圖1).

圖1 DNA濃度的標準曲線Fig.1 Standard curve of DNA concentration

1.2.6 RT-PCR 骨髓細胞RNA的提取:用Trizol法提取總RNA,提取的RNA應該保存于-70℃冰箱中,或者立即進行反轉錄,具體操作參照Yaghoobi等[6]的方法.實驗所用引物序列如下:

隨后進行 PCR,選用的目的基因為CYP1B1和Nucleostemin,選用的內參基因為β-actin 2,前后分開制膠.用凝膠成像系統照膠分析.數據用Origin 5.0統計軟件來分析,并進行t檢驗和繪圖.

2 結果與討論

2.1 甲醛暴露對骨髓組織細胞分裂周期的影響

由表2可見,氣態甲醛動態染毒對于SPF 級昆明種純系雄性小鼠的骨髓細胞細胞周期有明顯的影響作用, S期細胞含量明顯下降,而G2期細胞含量上升.對于 G1期的影響作用不顯著.S期是細胞DNA復制時期,可以推測甲醛暴露對于骨髓細胞DNA的復制過程有毒害作用;G2期的百分比回升,表明甲醛能抑制小鼠骨髓細胞進入M期,而使大量細胞停滯于 G2期.結果表明:甲醛暴露對能影響小鼠骨髓細胞的分裂與分化,甲醛對骨髓細胞生長產生毒害作用.

表2 甲醛暴露對骨髓細胞分裂周期的影響Table2 Formaldehyde exposure on bone marrow cell division cycle

2.2 甲醛暴露對骨髓組織細胞中遺傳物質DNA穩定性的影響

圖2 骨髓基因組DNA的電泳圖譜Fig.2 Gel electrophoresis of bone marrow DNA

提取的小鼠骨髓細胞DNA.通過ND-1000核酸微量定量儀檢測DNA濃度和純度,選擇OD260與OD280的比值在1.76～1.85的樣品進行DNA經瓊脂糖凝膠電泳(圖2).圖象呈現單一條帶,沒有拖尾現象,表明此方法提取純化得到的DNA具有很高純度.以此作為PCR擴增模版.

隨機擴增多態性DNA標記技術,是在PCR技術的基礎上發展起來的,它是以細胞的DNA為模板,以一系列隨機排列的不同寡聚核苷酸單鏈為引物進行擴增.若相應部位的基因組發生損傷,出現缺失、增加、移位等現象,就會使擴增DNA片段發生變化[7].本研究中,小鼠染毒后,不同染毒濃度下基因組DNA的RAPD圖譜發生了明顯的變化.經過統計(表3)發現:甲醛處理后,0.5mg/m3染毒組多態性條帶最多,且更易導致新帶的產生;1.0mg/m3濃度組則有較多條帶消失;而3.0mg/m3濃度組條帶變化數目最多,且較易引起擴增條帶強度的變化;由低濃度到高濃度,變化條帶數與甲醛升高而增多.甲醛的濃度與 RAPD圖譜的變化之間呈現良好的劑量-效應關系,說明甲醛濃度越高對小鼠骨髓DNA的損傷越嚴重.

表3 隨機多態性擴增結果Table 3 RAPD bands of control group and each concentration group

2.3 甲醛暴露引起的骨髓組織細胞DPC效應

如圖3所示,隨著甲醛濃度的升高,小鼠骨髓細胞DNA-蛋白質交聯系數逐漸升高,0.5mg/m3組與對照組存在顯著差異(P＜0.05),1.0、3.0mg/m3組與對照組存在極顯著差異(P＜0.01).表明在實驗濃度范圍內,甲醛可顯著誘導骨髓細胞DNA-蛋白質交聯物的形成.

圖3 不同濃度的氣態甲醛致DNA-蛋白質交聯的變化Fig.3 DNA-protein crosslinks induced by different concentrations of gaseous formaldehyde

從實驗結果可以看出,甲醛濃度與骨髓組織細胞中的DPC效應呈現良好的劑量-效應關系,即甲醛濃度越高,骨髓細胞中的DNA-蛋白質交聯程度越重.這與上述DNA穩定性研究的結果一致.從而可以顯示甲醛對骨髓細胞造成損傷.

本研究的結果與Heck等[8]實驗結果不同,Heck等認為吸入和食入的甲醛不能夠在體內隨血液轉運,且甲醛暴露沒有造成骨髓組織細胞的遺傳毒性;對此本課題組分析如下:①為什么體內甲醛濃度不隨外界甲醛濃度改變與改變.甲醛是內源物質之一,高濃度甲醛暴露,可能誘導甲醛脫氫酶的高效表達,加快甲醛的降解.但降解的醛基并沒有全部直接氧化生成CO2和H2O,主要是基團的轉移,即甲醛進入體內可能與其他生物分子結合,體內游離甲醛量沒有變,因此體內甲醛的含量不隨外界環境甲醛含量的變化而變化.②通過同位素標記甲醛分子中的C和H,然后檢查骨髓組織中是否含有同位素標記DNA-蛋白質交聯量即DPC含量并不科學.甲醛的還原性很強,易與多種物質結合,沒有特殊載體,不可能直接運到骨髓,目前還沒有發現這樣的載體.檢查甲醛有沒有造成骨髓遺傳毒性,不能只檢測同位素標記的DPC,生物體有許多基團轉位酶和異構酶,吸入的甲醛分子和最后造成毒性的分子不一定是同一被標記的分子.在他們實驗中沒有檢測到同位素標記的DPC,不等于甲醛暴露沒有造成骨髓組織中DPC的形成.

2.4 甲醛暴露對骨髓組織細胞分化關鍵因子的影響

本實驗考察小鼠骨髓細胞中NS基因,CYP1B1基因的表達情況,其中NS基因,CYP1B1基因與選用的β-actin 2表達情況如圖4所示.NS基因,CYP1B1基因在各濃度組暴露下均有表達.

圖4 CYP1B1和Nucleostemin基因的RNA表達結果Fig.4 The RNA expression results of CYP1B1 and Nucleostemin

圖5 CYP1B1基因與內參擴增產物的豐度比值Fig.5 The abundance ratios of CYP1B1 compared with β-actin 2

利用Origin 5.0分析NS基因,CYP1B1基因各自與內參擴增產物的豐度比值,并做圖分析.圖5顯示,甲醛暴露之后,CYP1B1基因在 0.5,1.0,3.0mg/m3濃度組中表達量.與空白組相比有極顯著差異.圖6顯示,甲醛暴露之后,各濃度染毒組與空白組相比, Nucleostemin的表達量發生了改變,其中,1.0mg/m3濃度組有極顯著性升高,而0.5和3.0mg/m3濃度組則是由極顯著性降低.

細胞色素 P450(CYP)是一類亞鐵血紅素—硫醇鹽蛋白的超家族,它參與內源性物質和包括藥物、環境化合物在內的外源性物質的代謝.作為發揮藥物代謝功能的主要I相代謝酶,CYP在肝臟中最為豐富.而肝外CYP的表達與功能及其與腫瘤發生的關系是近些年研究的熱點,Nagai等[9]利用 RT-PCR技術在人類髓系白血病細胞系和淋巴細胞系中對各種CYP基因的表達做了檢測,發現CYP1A1、CYP1B1、CYP2A6、CYP2A7、CYP2D6和CYP2E1在所有被檢測的細胞系中均有高表達.本實驗選用CYP1B1因子進行表達研究,結果顯示,各染毒組相較空白組,表達量都有明顯增高,其中1.0 mg/m3濃度組尤為明顯.說明甲醛暴露對骨髓組織中細胞色素P450表達有影響,CYP1B1因子上調,說明外源性甲醛暴露對引起骨髓組織發生癌變有關聯.

圖6 Nucleostemin基因與內參擴增產物的豐度比值Fig.6 The abundance ratios of Nucleostemin compared with β-actin 2

NS是一種新的p53結合蛋白,它參與干細胞和腫瘤細胞的增值調控.Ma等[10]認為NS是以P53依賴途徑調控著細胞的G1/S期的轉換.Kafienah等[11]利用小干擾RNA技術阻抑NS基因表達,發現 NS蛋白表達與細胞周期有關.由圖6可見,甲醛暴露之后,S期細胞數明顯少于對照組,NS的表達在 1.0mg/m3濃度組比空白組有極顯著上升,0.5mg/m3和3.0mg/m3濃度組與比空白組有極顯著下降.實驗結果說明,甲醛暴露對 NS的正常表達有極顯著影響.因此我們推測甲醛暴露對骨髓的干細胞分化是有影響.

3 結語

從本次研究可以看到,甲醛暴露可以造成骨髓細胞的DNA損傷,影響細胞分裂周期,并且在不同的暴露組中,可以使相關的細胞分化因子差異性表達.這些都說明外源性甲醛暴露對小鼠骨髓組織有毒性作用. 此項研究對評估甲醛暴露是否能增加白血病發生的風險具有重要意義.然而,甲醛暴露能否導致白血病,其機制如何,還需要進行持續性地研究.

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