三種抗環瓜絲氨酸抗體檢測試劑性能評價及臨床應用

趙 瀛，宋斌斌，郭 瑋，張春燕，談綺文，彭穎斐，潘柏申

(上海復旦大學醫學院附屬中山醫院檢驗科，上海200032)

類風濕性關節炎(RA)是一種慢性、炎癥性致畸性疾病，全球近0.5% ～1.0%的人群患有此病，其中75%是女性患者，發病2年即可出現不可逆的骨關節破壞。因此，RA的早期診斷和及時治療是防止關節受到進一步損害的關鍵。但長期以來一直缺乏一個對RA的早期診斷敏感而特異的指標。現行的1987年美國風濕病協會(ACR)診斷標準［1-2］主要依靠臨床表現、X-線以及類風濕因子(RF)的檢測，而符合此標準時患者常已出現骨關節破壞。同時由于RF特異性較差，在許多其他自身免疫性疾病、慢性感染或老年的健康人中都會出現［3-5］。所以，臨床期待找到一個更靈敏且特異性更好的預示指標。

大量的研究發現早期RA患者的血清和滑膜液中存在抗環瓜絲氨酸(CCP)抗體，而且陽性患者出現嚴重關節損傷的概率明顯高于陰性患者［6］。所以抗CCP抗體已被作為RA早期診斷及預后判斷的重要標志物。

隨著包被抗原和檢測技術的不斷提高，許多廠家上市推出了不同的抗CCP抗體檢測試劑，同一檢測項目同一樣本采用不同的檢測試劑可能會存在檢測差異，而且由于抗CCP抗體檢測缺乏國際參考物質，目前尚未標準化。因此，這些檢測試劑本身的分析性能，以及臨床實際應用情況成為了我們關注的焦點。

我們選用了羅氏、歐蒙和富純的3種抗CCP抗體檢測試劑，分別進行了分析性能的驗證和初步臨床應用的評估。

材料和方法

一、對象

所有對象早晨8～9時空腹采集靜脈血5 mL，1 h內分離血清，-80℃保存至檢測。

1.RA組 2010年7至11月復旦大學附屬中山醫院風濕科門診就診的RA患者93例，其中男18例，女75例，年齡18～86歲。診斷標準采用ACR的RA診斷標準［2］。

2.非RA疾病對照組 (1)各種自身免疫性疾病患者82例，包括系統性紅斑狼瘡28例、狼瘡性腎炎18例、ANCA相關性血管炎3例、干躁綜合癥7例、結締組織病7例、甲亢GRAVES病5例、溶血性貧血1例、韋格納肉芽腫1例、硬皮病2例、重癥肌無力2例、自身免疫性肝炎8例，其中男23例、女59例，年齡18～86歲;(2)骨關節炎患者36例，其中男12例、女24例，年齡26～83歲。

3.健康對照組 隨機選取復旦大學附屬中山醫院體檢的表面健康人群20名，其中男10名、女10名，年齡25～73歲。

二、儀器和試劑

1.試劑 (1)瑞士羅氏公司(簡稱羅氏)抗CCP抗體檢測試劑(SFDA注冊編號:國食藥監械(進)字2009第2402350號，批號165183)及配套校準品和質控品，檢測原理為電化學發光法，Cutoff值為17 RU/mL;(2)德國歐蒙公司(簡稱歐蒙)抗CCP抗體檢測試劑(SFDA注冊編號:國食藥監械(進)字 2008第 2402505號，批號E110729AK)及配套校準品和質控品，檢測原理為酶聯免疫吸附法，Cut-off值為5 RU/mL;(3)上海富純科新生物公司(簡稱富純)抗CCP抗體檢測試劑(SFDA注冊編號:國食藥監械(進)字2010第2400051號，批號EC110801)及配套校準品和質控品，檢測原理為酶聯免疫吸附法，Cut-off值為25 RU/mL。測試時各試劑盒均在有效期內。

2.儀器 Modular E170全自動電化學發光免疫分析儀(羅氏公司);ST-360全自動酶標讀數儀(上海科華生物技術有限公司);BK-W96A全自動洗板機(北京眾合百克科學儀器技術有限公司)。

三、方法

1.精密度比較 用3種試劑分別測定高、低2個濃度的樣本，每份樣本重復測定20次，計算各自批內的均數()、標準差(s)及變異系數(CV)，了解批內不精密度。采用3種試劑分別對該2份樣本各連續測定20 d，計算各自天間的、s及CV，了解天間不精密度。

2.線性比較 CCP高值混合血清與陰性混合血清按9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9比例稀釋，充分混勻后進行復管檢測，所有結果取均值后進行多項式回歸統計和線性評估［7］。

3.方法學比較 分別用3種試劑檢測CCP抗體，比較兩兩之間的相關性。

4.臨床應用評估 分別用3種試劑檢測RA組、非RA疾病對照組和健康對照組的CCP抗體水平，對檢測結果進行ROC曲線分析，并評價臨床RA的診斷特性。

四、統計學方法

結 果

一、精密度比較

3種試劑的批內和天間的不精密度結果見表1。各試劑的批內和天間精密度均較好，滿足臨床應用需要。

表1 精密度檢測結果

二、線性比較

剔除超限值后得到的3種試劑的預期值與實測值散點圖見圖1。3種試劑的檢測線性范圍的多項式回歸分析結果見表2。羅氏和歐蒙2種試劑檢測線性范圍基本覆蓋了廠商推薦的檢測范圍，而富純真實的線性范圍明顯低于廠商推薦的檢測范圍。

三、方法學比較

3種抗CCP抗體檢測試劑的相關性比較見圖2。

圖1 3種試劑線性評價

表2 3種試劑的檢測線性范圍多項式回歸分析

圖2 3種檢測試劑之間的相關性比較

四、臨床應用評估

1.3種試劑檢測各組抗CCP抗體的ratio值(濃度/Cut-off值)分布見圖3。3種試劑檢測的抗CCP抗體在RA組中的濃度明顯高于非RA疾病對照組和健康對照組。

2.3種試劑的ROC曲線和診斷特性參數見圖4和表3。3種試劑間的AUC差異均無統計學意義(Z 值分別為 0.27、0.89、0.63，P 均 ＞0.05)，表明診斷價值差異無統計學意義。

圖3 3種試劑檢測各組的抗CCP抗體濃度絕對值分布

圖4 3種試劑對于RA診斷的ROC曲線

表3 3種檢測試劑的診斷性能比較

討 論

抗CCP抗體作為RA的一個非常敏感且特異的指標，疾病的早期階段即可出現陽性，并且具有很高的陽性預期值。為了解目前常用抗CCP抗體檢測試劑應用情況，我們對羅氏、歐蒙、富純3種試劑的分析性能和臨床應用進行了評估。

在3種抗CCP抗體檢測試劑的精密度實驗中，低濃度和高濃度樣本的批內、天間CV均＜10%，符合定量試劑要求，均滿足臨床應用需要，其中羅氏的電化學發光法試劑盒屬于全自動免疫分析方法，其批內和天間CV最好，均＜3%。

在試劑檢測范圍的評估實驗中，根據EP06-A的方法評價了3種試劑的線性情況，通過多項式回歸方程分析發現3種試劑最適多項式均為一次多項式，可直接判斷為線性，進一步進行稀釋后得到真實的線性范圍，羅氏和歐蒙基本覆蓋了廠商推薦的檢測范圍，而富純真實的線性范圍明顯低于廠商的聲明目標。

本研究對3種抗CCP抗體檢測試劑的檢測結果之間的相關性進行了比較。3種試劑之間相關系數(r)均＞0.85，3種試劑之間相關性較好。特別值得一提的是歐蒙和富純2種試劑的檢測原理都是酶聯免疫吸附法，所以兩者的r高達0.97。由于這3種試劑均采用第二代重組環化的瓜氨酸肽類作為其抗原，所以避免了由于不同抗原所引起的差異，這與Coenen等［8］的研究結果一致，同時文獻報道相較第1代試劑而言，第2代試劑在不影響特異性的情況下提高了診斷靈敏度。但目前抗CCP抗體的檢測方法由于缺乏國際參考物質［9］，每個廠家采用其自身校準品進行校準，抗CCP抗體校準品及瓜氨酸表位中的差異已經被證實為不同方法之間可比性較差的根本原因。檢測方法間的一致性只有通過采用同種抗原才能實現。因此，在抗CCP抗體檢測標準化目標未達到之前，抗CCP抗體檢測方法間不可避免存在差異，這種現狀會給臨床應用尤其是不同醫療部門之間的結果比對和資料分析帶來困擾。

本研究結果證實RA組抗CCP抗體濃度明顯高于健康對照組、非RA疾病對照組。富純和歐蒙抗CCP抗體的ratio值高于羅氏。實驗表明抗CCP抗體的檢測對于RA患者具有很高的診斷價值，且能幫助臨床醫生鑒別診斷易與RA混淆的關節炎疾病。

在非RA的自身免疫性疾病中，28例SLE的患者中出現2例抗CCP抗體陽性(7.1%)，18例狼瘡性腎炎的患者中有2例抗CCP抗體陽性(11.1%)，7例干燥綜合征的患者中有1例抗CCP抗體陽性(14.2%)。已有報道顯示部分非RA的自身免疫性疾病患者會出現抗CCP抗體陽性。Mediwake等隨訪了231位SLE患者，發現SLE在疾病早期階段可能出現與RA同樣的關節損傷和畸形，侵襲性的SLE患者抗CCP抗體陽性達到20%，而非侵襲性的SLE患者抗CCP抗體陽性率僅為0.5%［10］。所以，雖然抗CCP抗體對于RA患者具有較高的特異性，但在一些自身免疫性疾病中也可能出現陽性。此時建議結合臨床表現，且與RF聯合檢測，以便提高RA與其他疾病之間的鑒別診斷能力。

在初步臨床應用分析中，本研究對231位受試對象的抗CCP抗體檢測結果進行ROC曲線分析，結果顯示3種檢測試劑的AUC基本相同，診斷特性差異不明顯。ROC分析顯示3種試劑診斷性能均較好，靈敏度相似，特異性羅氏最高。為了解3種試劑的確診值及排除值，本研究計算了3種試劑在診斷中的似然比，即在有病者中得出某一篩檢實驗結果的概率與無病者得出這一概率的比值，這能較全面客觀地反映篩檢實驗的診斷價值。陽性似然比＞10和陰性似然比＜0.1分別是確定及排除實驗令人信服的證據，3種試劑陽性似然比均＞10，所以對RA疾病具有明確診斷價值;然而由于抗CCP抗體在一些自身免疫性疾病中也可能出現陽性，所以其陰性似然比并未完全達到疾病排除的要求。采用ROC最適的Cutoff值，歐蒙和富純在不降低靈敏度的前提下，檢測特異性及陽性似然比均得以明顯提高，所以對于歐蒙和富純2種檢測試劑建議采用最適Cut-off值替代廠商推薦Cut-off值。

由于RA患者在首次就醫時通常并不完全符合RA的臨床診斷和分類標準，所以早期發現能幫助臨床醫生更好地進行診斷治療。而現今的治療手段僅著力于抗炎治療并不能達到治愈的目的，因此在發生關節損傷之前更需要早期診斷。Rantap??-Dahlquist等［11］和 Nielen 等［12］證實了抗CCP抗體能鑒別那些無癥狀但隨后會發展成為RA的隱匿型患者，抗CCP抗體陽性比RA癥狀的出現早4.5個月～9年。所以，抗CCP抗體在早期診斷方面發揮著重要的作用。本研究由于資源有限，未能將患者進行早期RA(出現首次癥狀之前＜1年)和已確診RA(RA診斷＞2年)的分類討論。所以在RA早期診斷方面，以上3種抗CCP抗體檢測試劑之間是否存在差異還尚待更進一步的研究闡明。

總的來說，3種抗CCP抗體檢測試劑的分析性能均滿足臨床應用需要，羅氏檢測系統的精密度略好，同時3種試劑對于RA的診斷價值也是相似的，所以抗CCP抗體不同試劑之間具有一定可比性。但試劑的標準化問題使得不同的抗CCP抗體檢測試劑的結果間不可避免存在差異，所以標準化仍是現今刻不容緩需要解決的難題。

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