植物乳桿菌K25對小鼠急性毒性和細菌移位實驗研究

趙玉娟，李盛鈺，牛春華，張雪，李達，楊貞耐

（吉林省農業科學院農產品加工中心國家乳品加工技術研發分中心，長春 130033）

植物乳桿菌K25對小鼠急性毒性和細菌移位實驗研究

趙玉娟，李盛鈺，牛春華，張雪，李達，楊貞耐

（吉林省農業科學院農產品加工中心國家乳品加工技術研發分中心，長春 130033）

通過小鼠急性毒性和細菌移位實驗，評價植物乳桿菌K25口服安全性。小鼠連續14 d灌胃不同劑量的植物乳桿菌K25，各試驗組小鼠在一般體征、臟器指數、血清和肝臟生化指標與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。且各劑量組小鼠血液、肝臟、脾臟和腸系膜淋巴結勻漿液中均未檢測到植物乳桿菌K25，說明未出現菌血癥變化和細菌移位現象。上述結果均表明植物乳桿菌K25安全無毒副作用。關鍵詞：植物乳桿菌；安全性評價；急性毒性；細菌移位

0 引言

乳酸菌的應用可追溯到二千多年前[1]，但最新研究表明可從菌血癥、心內膜炎和腦膜炎等患者體內分離出乳酸菌[2]，雖然這類報道病例相對較少，但卻引起人們對乳酸菌安全性問題的廣泛關注，尤其是即將引入人類食物鏈中的新菌株。因此對新分離的乳酸菌進行安全性評價顯得十分必要。

植物乳桿菌K25是本實驗室由西藏靈菇中自主分離得到。經體內外實驗表明該菌株具有良好的耐酸、耐膽鹽、細胞黏附作用，以及較好的降血脂和抗氧化功效(研究結果將另文發表)，是一株具有潛在益生特性的新菌株。因此，本研究按照相關國家標準，通過小鼠急性毒性和細菌移位試驗進行相關毒理檢測，評價植物乳桿菌K25的安全性，為該菌株進一步的應用開發提供安全實驗依據。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養基

植物乳桿菌(L.plantarum)K25[3]菌株在體積分數為30%甘油的MRS培養基中，-80℃凍存，使用前接種于MRS液體培養基，37℃連續活化3次。

液體MRS[4]培養基用于培養菌株，固體MRS培養基用于乳桿菌的活菌計數。

SS瓊脂培養基[5]用于沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌等腸道致病菌的活菌計數。

將活化的植物乳桿菌K25按體積分數為3%接種量接種于MRS液體培養基，37℃培養16 h，離心(8 000 r/min，4℃，10 min)，菌體沉淀用無菌生理鹽水洗滌2次后，無菌生理鹽水調整菌液濃度為2.1×1011，2.1×109和2.1×107mL-1，分別作為小鼠高、中和低灌胃劑量的菌懸液。

1.1.2 實驗動物

健康昆明種小鼠，體重18～22 g，清潔級，6周齡，購于長春高新醫學動物實驗研究中心。購回后進行適應性飼養3 d后分組進行試驗。試驗前禁食16 h，但不限制飲水。動物房溫度為（22±2）℃，相對濕度為50%±5%。

1.1.3 儀器與試劑

Cary 300 UV-VIS分光光度計，CR3i高速冷凍離心機，FSH-Ⅱ型高速電動勻漿器，BCH-1360B型生物潔凈工作臺。

谷草轉氨酶(GOT)測定試劑盒，谷丙轉氨酶(GPT)測定試劑盒，谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)測定試劑盒，丙二醛(MDA)測定試劑盒，尿素氮(BUN)測定試劑盒等，均購自南京建成生物工程有限公司。

1.2 急性毒性實驗

1.2.1 實驗方案

參照GB15193.3-2003[6]寇氏(korbor)法，將小鼠隨機分為高、中、低劑量和空白對照組，每組10只，雌雄各半。適應性飼養后高、中、低劑量組小鼠連續14 d灌喂不同劑量的植物乳桿菌K25菌懸液20 mL/(kg·d)，對照組小鼠灌胃等量無菌生理鹽水。

1.2.2 一般體征的觀察

每日清晨稱量并記錄小鼠體重、采食量(FI)。每12 h觀察小鼠的精神、運動、呼吸和死亡等狀況。計算小鼠的消費指數(CI)即采食量(FI)與體質量增重(WG)之比[7]。

1.2.3 臟器指數及肝臟、腎臟功能的測定

試驗結束前12 h禁食，但不限制飲水。飼養結束時稱量小鼠體重后摘除眼球并收集血液，分離血清測定丙二醛和尿素氮。摘取肝臟、腎臟、脾臟和心臟，生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重，各臟器重量與小鼠體重比值的百分數即為臟器指數。

準確稱取各組小鼠的肝臟0.5 g，加入4.5 mL無菌生理鹽水，勻漿后離心取上清液，制備成肝組織勻漿液，用于谷草轉氨酶(GOT)活性，谷丙轉氨酶(GPT)活性，谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)活性和丙二醛(MDA)活性測定。蛋白含量采用Lowry等[8]的方法測定。

1.3 細菌移位

參照Zhou等[9]方法，將40只雄性小鼠隨機分為高、中、低劑量和空白對照組，每組10只，經適應性飼養后高、中、低劑量組小鼠連續14 d灌喂不同劑量的植物乳桿菌K25菌懸液，灌喂劑量為20 mL/(kg·d)，對照組小鼠灌胃等量無菌生理鹽水。末次處理24 h后，乙醚麻醉小鼠，無菌心臟穿刺取血并收集血液樣本。解剖小鼠，無菌棉簽擦拭臟器表面，涂布于MRS和SS固體培養基，檢測小鼠內臟表面是否污染。無菌摘取腸系膜淋巴結(MLN)、脾臟和肝臟[10]，制備成組織勻漿液，分別取0.1 mL血液和臟器勻漿液，涂布于MRS、SS固體培養基。將各培養基于37℃培養48～72 h，記錄各培養基上有植物乳桿菌K25菌落生長的小鼠數量，即使有一個菌落生長也認定為陽性細菌移位，按下列公式計算細菌移位發生率，即

細菌移位發生率（%）=有K25菌落生長的小鼠數量/受試小鼠總數×100%。

1.4 數據分析

采用DPS軟件處理數據。計量資料以表示；計量資料組間差異比較采用ANOVA統計分析。

2 結果與討論

2.1 一般體征觀察

在灌胃植物乳桿菌K25活菌液的試驗過程中，小鼠生長和精神狀況良好，攝食、飲水、呼吸和排泄等方面均正常，未出現腹瀉、疾病病例，到試驗結束為止，無一例中毒或死亡病例。并且各試驗組小鼠的被毛光滑且有光澤，試驗組和對照組之間無明顯差異。各組小鼠體重變化情況如圖1所示。小鼠在灌胃期間，體重均呈增加趨勢，與灌胃前相比，除低劑量組增長較少外(7～8 g)，灌胃14 d后各組體重均增加9～11 g，各劑量組與對照組相比無明顯的體重變化規律，不同劑量組之間無劑量效應，差異性不顯著(P＞0.05)，即表明在試驗期間，各小鼠體重增長與灌喂植物乳桿菌K25菌懸液之間無明顯的關聯作用。結果與Zhou[9]和Tasaki[11]研究結果相一致。

各試驗小鼠灌服植物乳桿菌K25后消費指數的變化情況如表1所示。飼養至第5天時，高、中劑量組的雄性和雌性小鼠和低劑量組的雄性小鼠CI均低于對照組，差異顯著(P＜0.05)，說明在灌服植物乳桿菌的初期，一定程度上提高了小鼠對飼料利用效率。Bernardeau等[7]將L.rhamnosusMA27/6B和L.acidophilusMA27/6R通過飲水的方式讓小鼠連續服用17天后，發現服用108CFU/mL的活菌/死菌液處理組小鼠的消費指數均明顯低于對照組。而隨著飼養時間的延長，各實驗組小鼠的消費指數差異不顯著(P＞0.05)。而低劑量組雌性小鼠的CI均高于對照組，并且在小鼠適應性飼養期間發現這些小鼠體質相對較弱，生長緩慢，因此對飼料的利用率相對較差。

表1 各組小鼠灌服植物乳桿菌K25后消費指數的變化情況(n=5，±s)

表1 各組小鼠灌服植物乳桿菌K25后消費指數的變化情況(n=5，±s)

注：*為與對照組相比數據間差異顯著（P＜0.05）。

飼養5 d飼養10 d飼養14 d組別高劑量組中劑量組低劑量組對照組雄性9.12±1.41 9.54±1.22 9.54±1.37 12.36±1.16*雌性9.85±1.36 9.33±1.31 12.47±1.16 11.55±1.24*雄性14.23±1.15 13.94±0.87 13.51±1.59 13.85±1.28雌性16.99±1.22 16.43±1.77 18.48±1.53 16.62±1.12雄性15.84±1.03 15.29±1.55 15.66±1.24 15.46±1.49雌性18.16±1.79 18.43±1.48 19.74±2.18 18.67±1.01

2.2 小鼠急性毒性實驗

根據急性毒性實驗國標(GB 1519313-2003)得出以下結論：小鼠連續灌胃植物乳桿菌K25半數致死量(LD50)大于4.0×1012kg-1，小鼠未出現異常表現，如精神不振、死亡等現象。查表得知，植物乳桿菌K25為無毒級別。最大耐受劑量(MTD)大于4.0×1012kg-1。

2.3 臟器指數的測定

圖2為灌服植物乳桿菌K25后小鼠臟器指數的變化情況。由圖2可以看出，各組小鼠灌胃14 d后，心臟指數在0.4%～0.5%、肝臟指數在4.8%～5.3%、腎臟指數在1.32%～1.4%之間波動，各組之間差異不顯著(P＞0.05)。中劑量組的脾臟指數與其他組相比差異顯著(P＜0.05)，但是這種脾臟指數的波動無明顯的劑量效應，所以小鼠脾臟指數的變化與灌服植物乳桿菌無相關性。心臟指數是反映身體健康情況的一個指標，肝和腎是身體重要的排毒解毒器官，其指數變化程度可以從另一方面反映灌胃物質的毒性程度[12]，而本研究中各試驗組小鼠的體重和臟器重量無明顯的變化，結果與孫潔宇[12]和Kai-Chien Lee[10]相一致。

2.4 生化指標的測定

各組小鼠血清MDA濃度變化如圖3所示。由圖3可以看出，血清MDA濃度在11～13 nmol/mL之間波動，且各組之間差異不顯著(P＞0.05)，且試驗組小鼠的MDA濃度低于對照組，證明當給小鼠灌胃植物乳桿菌K25后，沒有引起小鼠的敗血癥病變。

尿素氮（BUN）是機體蛋白質代謝的主要終末產物之一，當腎臟功能受損而引發腎臟疾病，如慢性腎炎、腎盂腎炎等，則血尿素氮的濃度升高。本研究中各組小鼠的血尿素氮濃度變化如圖4所示，BUN濃度在7.3～7.8 mmol/L之間波動，各實驗組的BUN濃度均低于對照組，且各實驗組之間差異不顯著(P＞0.05)，說明灌胃植物乳桿菌K25未引起各劑量組小鼠腎臟功能的改變。

谷胱甘肽S-轉移酶(GST))屬Ⅱ相代謝酶系，是催化外來化合物的中間代謝產物與谷胱甘肽(GSH)結合的關鍵酶，谷丙轉氨酶(GPT)和谷草轉氨酶(GOT)是參與氨基酸代謝的酶，是肝臟功能損害最敏感的檢測指標，當肝細胞輕度受損時上述三種酶活性即發生明顯的變化，指示肝功能的急性受損。植物乳桿菌K25對小鼠肝功能的影響如表2所示，各試驗組小鼠的谷丙轉氨酶活性相似，組間差異不顯著(P＞0.05)；與對照組相比，高、低劑量組小鼠的谷胱甘肽S-轉移酶、丙二醛和谷草轉氨酶活性差異不顯著(P＞0.05)，且二者組間差異不顯著。而中劑量組中小鼠肝組織功能的變化無明顯的劑量效應，說明實驗鼠經14 d灌胃植物乳桿菌K25，未引起肝臟組織功能的損傷。

2.5 細菌移位的測定

細菌移位是益生菌安全性評價中重要的評價內容之一，細菌移位是腸道條件性菌株發生致病性的第一步。最新的研究表明由于完整的腸屏障被打破，或免疫功能低下，或者在潛在的疾病條件下服用乳酸菌后發生細菌移位，誘導菌血癥、敗血病和心內膜炎等疾病的發生[13-14]。至2007年，國外報道了至少73例與乳桿菌相關的心內膜炎病例，最常被分離得到的菌株是干酪乳桿菌，隨后是鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌[15]。因此，采用動物試驗對乳酸菌的移位能力進行評估是很必要的。

表2 各試驗組小鼠肝組織酶活力的變化情況U/mg

表3 各試驗組小鼠的細菌移位情況

植物乳桿菌K25的細菌移位評價結果見表3。根據陽性細菌移位判定標準，即在乳酸菌選擇性培養基MRS中有1個菌落也為陽性，而各小鼠的臟器表面、腸系膜淋巴結(MLN)、脾臟、肝臟和血液的MRS培養基均未檢測到任何細菌的生長，說明植物乳桿菌K25不會發生通過腸道屏障到達腸系膜淋巴結和腸腔外其他器官的細菌移位現象。這與已報道的一些乳桿菌如干酪乳桿菌Zhang[12]、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）GG[16]、唾液乳桿菌（L.salivarius）CECT5713[17]、嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）LA-1[18]、鼠李糖乳桿菌HN001、嗜酸乳桿菌HN017、乳雙歧桿菌HN019[19]、德氏乳桿菌UO 004[20]和乳酸乳球菌NZ9000[10]不發生細菌移位的結果相一致。

采用MRS和SS培養基對各組小鼠的血液進行培養，均無任何細菌生長，說明各試驗組各劑量的小鼠均未出現菌血癥。而有少部分SS瓊脂培養基中培養出黑色、有金屬光澤的菌落，這是典型的沙門氏菌菌落。如低劑量組1份小鼠的臟器表面、MLN、肝臟和脾臟均培養出沙門氏菌菌落，分析原因是該小鼠可能患有沙門氏菌感染，因為在飼養過程中，低劑量組有一只小鼠生長緩慢、行動遲緩，結合細菌培養結果分析該小鼠是因為感染沙門氏菌病而導致生長緩慢。另外，對照組2份小鼠的MLN中檢出沙門氏菌菌落，而其他組織器官均未檢出沙門氏菌，分析原因是在分離腸系膜淋巴結時誤將小腸段混入，而帶入了沙門氏菌。

3 結論

急性毒性試驗結果表明，小鼠口服植物乳桿菌K25最大耐受劑量(MTD)大于4.0×1012kg-1，根據急性毒性試驗國家標準(GB15193.3-2003)可以得出植物乳桿菌K25為無毒級別。小鼠血清和肝組織勻漿液的各項生化指標分析結果表明，植物乳桿菌K25未引起小鼠肝臟和腎臟功能的改變。另外，灌胃植物乳桿菌K25活菌液不能引起小鼠菌血癥和細菌移位。上述實驗結果表明植物乳桿菌K25是安全無毒的，并為該菌株的進一步應用提供了理論依據。

[1]ASILJEVIC T,SHAH N P.Probiotics—From Metchnikoff to Bioactives[J].Int.Dairy J.,2008,18(7):714-728.

[2]CANNON J P,LEE T A,BOLANOS J T,et al.Pathogenic Relevance of Lactobacillus:a Retrospective Review of Over 200 Cases[J]. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.,2005,24(1):31-40.

[3]王輯,張雪,李達,等.植物乳桿菌K25在發酵乳中的應用[J].農產食品科技, 2011,5(2):10-14.

[4]凌代文,東秀珠.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業出版社, 1999.

[5]林一曼,邱亞群,張倩,等.SS培養基儲存不同條件下對腸道菌檢測效果觀察[J].中國熱帶醫學,2006,6(1):126-127.

[6]GB 15193.3-2003.急性毒性試驗[S].北京：中國標準出版社,2003, 17-31.

[7]BERNARDEAU M,VERNOUX J P,GUEGUEN M.Safety and Efficacy of Probiotic Lactobacilli in Promoting Growth in Post-weaning Swiss Mice[J].Int.J.Food Microbio.,2002,77(25):19-27.

[8]LOWRY O H,ROSEBROUGH N J,FARR A L,et al.Protein Measurement with the Folin Phenol reagent[J].J.Biol.Chem.,1951, 193(1):265-275.

[9]ZHOU J S,SHU Q,RUTHERFURD K J,et al.Acute Oral Toxicity and Bacterial Translocation Studies on Potentially Probiotic Strains of Lactic Acid Bacteria[J].Food Chem.Toxicol.,2000,38(2-3):153-161.

[10]LEE K C,LIU C F,LIN T H,et al.Safety and Risk Assessment of the Genetically Modified Lactococci on Rats Intestinal Bacterial Flora [J].Int.J.Food Microbiol.,2010,142(1-2):164-169.

[11]TASAKI M,UMEMURA T,MAEDA M,et al.Safety Assessment of Ellagic Acid,a Food Additive,in a Subchronic Toxicity Study Using F344 Rats[J].Food Chem.Toxicol.,2008,46(3):1119-1124.

[12]孫潔宇,高鵬飛,麻士衛,等.益生菌Lactobacillus caseiZhang凍干粉對小鼠急性毒性的研究[J].中國農業科技導報,2009,11(5):77-82.

[13]LIONG M T.Safety of Probiotics:Translocation and Infection[J]. Nutr.Rev.,2008,66(4):192-202.

[14]De Groote M A,Frank N D,Dowell E,et al.Lactobacillus RhamonosusGG Bacteremia Associated with Probiotic Use in a Child with Short Gut Syndrome[J].Pediatric Infect.Dis.J.,2005,24(3):278-280.

[15]VANKERCKHOVEN V,MOREILLON P,PIU S,et al.Infectivity ofLactobacillus RhamnosusandLactobacillus ParacaseiIsolates in a Rat Model of Experimental Endocarditis[J].J.Med.Microbiol.,2007,56 (8):1017-1024.

[16]SALMINEN S J,DONOHUE D C.Safety Assessment ofLactobacillusStrain GG(ATCC 53103)[J].Nutr.Today,1996,31(6):12-15.

[17]LARA-VILLOSLADA F,SIERRA S,DíAZ-ROPERO M P,et al. Safety Assessment of the Human Milk-isolated ProbioticLactobacillus SalivariusCECT 5713[J].J.Dairy Sci.,2007,90(8):3583-3589.

[18]RUSELER-VAN EMBDEN J G,VAN LIESHOUT L M,GOSSELINK M J,et al.Inability ofLactobacillus CaseiStrain GG,L.Acidophilus,andBifidobacterium Bifidumto Degrade Intestinal Mucus Glycoproteins[J].Scand J.Gastroenterol.,1995,30(7):675-680.

[19]ZHOU J S,SHU Q,RUTHERFURD K J,et al.Safety Assessment of Potential Probiotic Lactic Acid Bacterial StrainsLactobacillus RhamnosusHN001,Lb.AcidophilusHN017,andBifidobacterium LactisHN019 in BALB/c Mice[J].Int.J.Food Microbiol.,2000,56(1): 87-96.

[20]FERNáNDEZ M F,BORIS S,BARB?S C M.Safety Evaluation ofLactobacillus Delbrueckiisubsp.LactisUO 004,a Probiotic Bacterium[J]. Res.Microbiol.,2005,156(2):154-160.

Acute oral toxicity and bacterial translocation evaluation of Lactobacillus plantarum K25

ZHAO Yu-juan,LI Sheng-yu,NIU Chun-hua,ZHANG Xue,LI Da,YANG Zhen-nai
(Center of Agro-Food Technology,Jilin Academy of Agricultural Sciences,National R&D Center for Milk Processing, Changchun,130033，China)

To evaluate the safety ofLactobacillus plantarumK25,we carried out the acute oral toxicity and bacterial translocation in mice.Different dose ofL.plantarumK25 were given to mice orally by gavage for 14 consecutive days.Compared with control,there are no significant differences(P＞0.05)in general signs,organs index,and biochemistry parameters of serum and liver with different dose ofL.plantarumK25. We don’t detecte the treatment-associated bacterial translocation in blood and homogenate of liver,kidney and mesenteric lymph nodes (MLN).The result of acute toxicity and bacterial translocation shows thatL.plantarumK25 has no toxicity and side effects.

Lactobacillus plantarum;safety assessment;acute toxicity;bacterial translocation

Q93-33

A

1001-2230（2012）05-0009-04

2011-11-29

國家自然科學基金項目（No31071574），農業部現代農業產業技術體系建設專項資金資助項目（CARS-37）和吉林省博士后基金項目（200904008）共同資助。

趙玉娟（1980-），女，助理研究員，研究方向為乳品微生物與功能評價。

楊貞耐